心脏连接蛋白43羧基末端相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

论文摘要

研究背景：连接蛋白43（connexin43，Cx43）是心脏表达最丰富的连接蛋白，主要分布在心室，其构成的缝隙连接（gap junction，GJ）在心肌细胞中的电耦联及化学信息交流（缝隙连接通道介导的细胞间通讯）中起着非常重要的作用。GJ通道功能的正常是心脏正常功能发挥的重要保证。近年来的研究亦表明细胞间电耦联障碍是心律失常的另一个重要原因，其所起的致心律失常作用甚至比兴奋性异常及膜离子通道功能紊乱起了更重要的作用。另外，GJ在心脏基因转录、发育调控、缺血心肌的保护等方面也发挥重要的调控作用。已知Cx43构成的GJ通道的功能受到胞内pH值、胞内Ca2+浓度、ATP浓度、Cx的磷酸化状态、跨通道电压和一些神经体液因子等多因素的调节，且大多数的功能调节位点位于胞浆内羧基末端。近年的研究发现，蛋白质—蛋白质相互作用是很多细胞功能的重要基础，因此明确心肌细胞内哪些蛋白质与Cx43存在相互作用，将非常有利于进一步阐明GJ通道蛋白的转录、翻译、翻译后加工修饰、转运及定位、量控制及降解等细胞内处理过程，同时将有助于发现新的GJ通道蛋白质调控因子，为开发治疗GJ通道异常所致心律失常的蛋白质药物奠定基础。研究目的：筛选心脏中哪些蛋白质与缝隙连接通道连接蛋白43羧基末端之间存在蛋白质-蛋白质相互作用，为进一步研究这些通过相互作用而形成的蛋白质复合体对缝隙连接通道的功能调控作用打下基础。研究方法：①通过PCR方法得到编码心脏Cx43羧基末端（AA235-382）的cDNA片段，并在其两端分别加上EcoRI和BamHI酶切位点，应用EcoRI／BamHI酶切PCR产物及pGBKT7空载体，凝胶分离后应用T4连接酶进行连接；②通过化学转化法将pGBKT7-Cx43-CT转化酵母菌AH109；③通过“尿素／SDS”法从被转化的酵母菌中提取蛋白质；④应用抗C-myc抗体，通过western blot方法检测“诱饵”蛋白的表达（即Gal4-BD-C-myc-Cx43-CT融合蛋白）；⑤检测“诱饵”蛋白自我激活报告基因与否，并测试是否需以最优化3-AT浓度抑制内源性His3蛋白表达；⑥将已被“诱饵”质粒转化的AH109与人心脏cDNA文库进行杂交，严格筛选阳性克隆，并经酵母体内蛋白质相互作用一对一重验证后分离阳性克隆中的cDNA，并测序；⑦将测序所得到的DNA序列输入美国国立医学图书馆的BLAST数据库进行BLAST同源性分析。研究结果：①诱饵载体测序结果证明，pGBKT7中的“Gal4 DNA bindingdomain-C-myc”与Cx43的羧基末端在同一读框中；②“诱饵”质粒转化AH109酵母菌成功率100％；③从被转化的AH109中能提取到浓度满意的总蛋白；④Western blot能检测到特异性条带，其位置与Gal4-BD-C-myc-Cx43-CT的分子量相当；⑤“诱饵”蛋白不能自激活报告基因Ade2和Mell，但可白激活His3，5mmol／L的3-AT可有效抑制“诱饵”蛋白本身自激活报告基因His3，以利于下一步的杂交筛选；⑥cDNA文库筛选并经一对一酵母体内重验证后共得到10个阳性克隆，确定7种“猎物”蛋白与心脏Cx43羧基末端存在蛋白质相互作用。结论：心脏连接蛋白43羧基末端能与心肌细胞中的多种蛋白质存在相互作用，这些蛋白质可能参与对缝隙连接通道的功能调控，从而在心脏的多种病理生理过程中发挥作用。

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