论文摘要
目的细胞凋亡与许多疾病的发生直接相关,一直是各学科研究的热点,近年研究提示细胞凋亡在缺血性心脏病的发生发展中发挥重要作用,在心肌梗死早期,细胞凋亡是心肌细胞死亡的主要形式,细胞坏死跟随在细胞凋亡之后,凋亡在早期心室重构中起重要作用。越来越多的资料表明,在心肌梗死后晚期,仍然有心肌细胞凋亡存在,临床研究证实,在心肌梗死后10～62d,患者梗死区与非梗死区均出现细胞凋亡,且与进行性心室重构、心力衰竭密切相关。目前认为细胞凋亡是除细胞坏死外,心肌梗死后心衰及不良预后的另一重要原因。Ⅱ型糖尿病是冠心病最常见的合并症之一。研究表明,冠心病合并糖尿病或者心肌梗塞后发生应激性高血糖症患者病情严重程度增加,且愈后不佳,其机制也是研究的热点之一。高葡萄糖可通过氧化应激等诱导细胞凋亡,我们推测高葡萄糖可能也对缺氧心肌细胞凋亡产生影响而影响冠心病病情及预后。心肌细胞一旦坏死,目前尚无办法干预,而细胞凋亡是受一系列程序控制的过程,人们可能通过干预死亡程序加以挽救,因此,研究缺血心肌细胞凋亡机制,给缺血损伤的防治开辟了一条新的途径。目前缺血缺氧损伤中心肌细胞凋亡的具体机制仍不清楚。缺氧诱导因子1（Hypoxia induciblefactor 1,HIF-1）是缺氧反应的主要调节因子,通过调节葡萄糖、铁和能量代谢、血管活性、酸碱平衡及细胞存活与凋亡的平衡,调节缺氧适应。程序性细胞死亡的信号通路的许多调节因子都受HIF-1调节,我们推测HIF-1可能参与心肌细胞缺氧凋亡及高葡萄糖对心肌细胞缺血损伤的影响。关于HIF-1在心肌细胞凋亡中作用的研究目前还处于起始阶段,少量研究结果不尽一致。目前,HIF-1在心肌细胞缺氧凋亡中的作用及机制有待进一步确证阐明。而关于HIF-1与高葡萄糖对心肌细胞缺血损伤影响的相关研究还未见报道。为证明我们的推测,本课题拟通过体外培养原代乳鼠心肌细胞,缺氧及高葡萄糖处理细胞,用化学抑制剂YC-1抑制HIF-1α,探讨HIF-1α信号转导系统对心肌细胞缺氧凋亡的影响及高葡萄糖对其影响。方法1、HIF-1对缺氧乳鼠心肌细胞存活及凋亡的影响及机制原代培养出生1-2d的Wister大鼠的心肌细胞,培养第4天的心肌细胞分别在正常氧、缺氧、缺氧加HIF-1α抑制剂YC-1（3-（5′-hydroxymethyl-2′-furyl）-1-benzylindazole）条件下培养细胞24h,缺氧采用氯化钴（cobalt chloride,CoCl2）模拟缺氧。用台盼兰染色检测细胞存活率,用TUNEL染色法和Hoechst33258荧光染色法及AnnexinV-PI双染流式细胞仪等多种方法检测细胞凋亡,免疫印迹（westernblot）法检测HIF-1α及其靶基因BNIP3的蛋白水平;半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达,观察HIF-1α、BNIP3在缺氧细胞凋亡时的变化及HIF-1α抑制剂YC-1对HIF-1α、BNIP3和缺氧细胞凋亡的影响。2、高葡萄糖对心肌细胞缺氧凋亡及HIF-1α信号系统的影响原代培养4d的乳鼠心肌细胞,予高浓度葡萄糖（33 mmol/L）,分别在正常氧及缺氧培养条件下培养24h,缺氧采用CoCl2模拟缺氧环境,同时以正常浓度葡萄糖（5.5 mmol/L）分别进行正常氧及缺氧培养作为对照。然后用台盼兰染色检测细胞活力;用TUNEL染色法和Hoechst33258荧光染色法及AnnexinV-PI双染流式细胞仪等多种方法检测细胞凋亡;采用RT-PCR检测HIF-1α及BNIP3的mRNA表达;采用Western blot检测HIF-1α及BNIP3的蛋白表达。免疫细胞化学染色检测HIF-1α蛋白核转位。结果1、HIF-1对缺氧乳鼠心肌细胞存活及凋亡的影响及机制（1）与正常氧时比较,缺氧24h HIF-1αmRNA及蛋白水平均明显增加（均P＜0.01）。BNIP3 mRNA及蛋白水平亦增加（P＜0.01）,乳鼠心肌细胞凋亡率增加（P＜0.01）。（2）YC-1抑制HIF-1α后,与单纯缺氧时比较,HIF-1αmRNA表达无明显改变（P＞0.05）,蛋白水平降低（P＜0.01）,BNIP3 mRNA及蛋白水平均明显降低（均P＜0.01）,细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）。2、高葡萄糖对乳鼠心肌细胞缺氧凋亡及HIF-1信号系统的影响细胞存活与凋亡改变:正常氧条件下,高葡萄糖时较正常葡萄糖时乳鼠心肌细胞存活率降低（P＜0.01）,凋亡率增高（P＜0.01）;缺氧条件下,高葡萄糖较正常葡萄糖时,细胞存活率增高（P＜0.01）,凋亡率降低（P＜0.05）。HIF-1α改变:在正常氧条件下,高葡萄糖时较正常葡萄糖时心肌细胞HIF-1αmRNA表达无明显差别,蛋白水平增高（P＜0.05）;在CoCl2模拟缺氧24h条件下,高葡萄糖时与正常葡萄糖时比较,HIF-1αmRNA表达及蛋白水平均无明显差异（P＞0.05）。抗-HIF-1α免疫细胞化学染色显示在在正常氧条件下:正常葡萄糖时未见明显HIF-1α蛋白表达,在高葡萄糖时部分细胞见明显HIF-1α的细胞核转位（P＜0.01）;缺氧条件下,正常葡萄糖时,较多细胞见极明显的HIF-1α胞浆积聚及细胞核转位积聚;而高葡萄糖时出现部分细胞HIF-1α胞浆积聚,但未见明显核转位。BNIP3改变:在正常氧条件下:BNIP3 mRNA表达及蛋白水平在高葡萄糖时与正常葡萄糖时比较均无显著差别（P＞0.05）,在缺氧情况下,高葡萄糖时BNIP3mRNA表达及蛋白水平均明显较正常葡萄糖时下降（P＜0.01）。结论1、HIF-1α介导乳鼠心肌细胞缺氧凋亡,BNIP3可能是HIF-1α介导乳鼠心肌细胞缺氧凋亡的分子基础之一。2、高葡萄糖在正常氧条件下,诱导乳鼠心肌细胞凋亡;CoCl2模拟缺氧条件下,高葡萄糖在乳鼠心肌细胞凋亡损伤中发挥保护作用。高葡萄糖可能通过影响HIF-1信号系统而影响心肌细胞凋亡。