重组组织型纤溶酶原激活剂变异体（RETEPLASE）工程菌的培养与体外复性的研究

论文题目: 重组组织型纤溶酶原激活剂变异体（RETEPLASE）工程菌的培养与体外复性的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 孔扬

导师: 张长铠,王革

关键词: 中文商业用名瑞替普酶,蛋白复性,包涵体,二硫键异构酶辅助蛋白复性,分子排阻色谱辅助蛋白复性

文献来源: 山东大学

发表年度: 2005

论文摘要: 目前，蛋白质作为新兴的大分子药物正进行着前所未有的研究和开发。通过重组DNA技术，可以使目的基因有效的在异源宿主细胞中实现转化和表达，但宿主细胞对于重组蛋白的数量和质量有较大影响。由于原核细胞和真核细胞在蛋白的翻译、翻译后修饰以及折叠的机制不同，因此在细菌宿主如大肠杆菌（Escherichia coli）中生产动物蛋白常常无法获得可溶的、有天然活性的蛋白。Reteplase（中文商业用名瑞替普酶）是第三代溶血栓药物，该产品不但生产工艺简单，在临床上更具有药物半衰期长、溶栓作用强、副作用小等优点。Reteplase是组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的衍生体，在t-PA分子原有结构的基础上进行了功能域的删除，保留了kringleⅡ、蛋白酶两个功能域及N端的3个氨基酸；该重组突变体是单链非糖基化蛋白，由355个氨基酸组成，分子量约为39 kD，含9对二硫键，是一种在体外很难复性的蛋白。尽管现已发现不少表达宿主，当目的产物的功能不依赖于糖基化修饰时，E．coli仍然是首选的表达系统。在E．coli中，目的蛋白能够在很短的时间内实现高水平表达，但多数情况下，表达产物在胞内以无活性的聚集物——包涵体的形式存在。为减少包涵体聚集，促进目的蛋白尽量以具有天然活性的形式表达，目前已尝试过多种方法。我们尝试用不同的表达体系，包括真核系统毕赤酵母（Pichia pastoris），在E．coli中用含有信号肽的质粒将目的蛋白在细胞周质中表达，然而，以天然活性形式表达蛋白的效果并不令人满意。因此，以包涵体的形式生产蛋白更容易为人们接受，因为包涵体可以很容易的分离而且含高水平具有正确一级结构的蛋白。其中，体外复性的过程是关键所在，通过对每一步精细设计，可使其更具可操作性。如能开发出有效的复性工艺，利用包涵体蛋白可以获得满意的产量。这是我们利用E．coli BL21菌株和含有T7强启动子的pET22b质粒，以包涵体的形式生产Reteplase的主要原因。通过体外复性产生有活性的天然蛋白是这项工作的关键。以包涵体形式表达目的蛋白时，包涵体蛋白表达量高，且能抵御蛋白酶的水解。当目的产物对宿主有毒性或具致死性时，选择以包涵体的形式表达目的蛋白将是非常可行的。生产包涵体的工程菌培养条件优化比生产可溶蛋白的工程菌培养条件优化要简单。在发酵培养中，我们对诱导剂IPTG的浓度、诱导时间、葡萄糖浓度对诱导的影响、培养温度和溶氧等条件进行了摸索。实验结果表明，IPTG浓度为80μM，诱导后培养时间4～5 h，葡萄糖浓度控制在0.1 g／L以下，培养温度40℃，溶氧保持在20％为培养的最佳条件。在2L的发酵罐重复实现了菌密度OD值40和包涵体蛋白表达率约30％的结果。包涵体经过简单的洗涤纯化，可以获得纯度85％以上的包涵体蛋白，用于后续的复性。蛋白质的体外复性是一个复杂的过程，需要精心设计。一旦高表达的包涵体蛋白可以有效转化成为可溶的活性蛋白，此项工作将变得更有意义。我们应用了三种原理不同的方法对Reteplase进行体外复性。1、传统的稀释复性。在复性缓冲液中加入GSH／GSSG对，促进二硫键的形成，并添加L-精氨酸来抑制聚集。2、二硫键异构酶（PDI）辅助复性。3、色谱法辅助复性，主要利用改良的分子排阻凝胶色谱辅助复性。将变性蛋白在大量的复性缓冲液中稀释是最常用的方法。但低蛋白浓度和巨大的反应体积是其工业化放大过程主要的问题。对稀释复性的各种条件进行了优化，如蛋白浓度、GSH／GSSG浓度和比率、L-精氨酸的浓度、复性时间。在蛋白终浓度0.1mg／ml条件下获得复性率2％。二硫键异构酶（PDI）能催化天然二硫键的形成，而这通常是折叠过程中的限速步骤。PDI还具有分子伴侣的功能，能够抑制聚集。我们以稀释复性缓冲液为基础，调试不同PDI与目的蛋白摩尔浓度，获得了复性率13.2％的结果。从整个工艺的成本考虑，操作中必须加入额外的分离步骤，并且重复使用分子伴侣也是一个障碍。分子伴侣和折叠酶与蛋白的有效作用必须符合化学计量关系，这种特性也增加了产品的成本，就目前来看，很难用于大规模的工业生产。利用层析柱对包涵体蛋白辅助复性相对于传统的复性是一种很好的替代方法。这种方法是利用现有的色谱技术提高蛋白正确折叠。它具有以下优点：1放大不走样，从小试到规模化生产使用的技术与获得的产率大致相同。2容易自动化，确保迅速和高通量处理样品。3对于结构相似的蛋白具有通用性，工艺不需重新改造便可应用于新基因序列。我们比较了各种层析法复性的原理，根据现有的实验条件，将分子排阻色谱法（SEC）应用于Reteplase辅助复性。我们利用改良的分子排阻色谱对Reteplase进行复性，以G25-M为填料；分别在SEC柱中形成变性剂梯度、pH梯度、变性剂梯度和pH双梯度，以促进蛋白复性率提高。分别对上样量、流速进行优化，可以获得优于稀释复性的结果。其中变性剂梯度和pH双梯度SEC对复性率的提高最为明显。在上样蛋白浓度4mg／ml，洗脱流速0.4mL／min时，复性率达到9.2％，（蛋白最终浓度0.32mg／ml），复性率高于宝灵曼公司（Boehringer Mannheim）同类产品。宝灵曼公司主要利用稀释法复性Reteplase，复性率约5％；并且采用分子排阻色谱辅助复性对样品的纯度要求不很严格。我们将ETI-Sepharose4B亲和层析柱，用来纯化Reteplase。刺桐胰蛋白酶抑制剂（ETI）是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂类，而Reteplase是精氨酸特征性的丝氨酸蛋白酶，它能被ETI作用点上的Arg63识别并产生可逆性结合；据此可以用ETI作为亲和填料来纯化Reteplase。利用酵母工程菌株制备了ETI蛋白，并与Sepharose 4B偶联，制成ETI-Sepharose4B亲和层析柱，得到很好的纯化效果。最后对本论文进行总结与展望。

论文目录:

中文摘要

Abstract

论文缩写词表

第一章绪论

1.1 溶血栓药物的研究概况

1.2 表达系统研究概况

1.2.1 酵母和丝状真菌表达体系

1.2.2 培养哺乳动物细胞生产重组蛋白

1.2.3 E.coil表达体系

1.3 利用E.coli生产重组蛋白

1.3.1 包涵体的体外复性

1.3.2 复性过程中的"瓶颈"

1.3.3 二硫键的形成

1.3.4 包涵体蛋白的复性方法

参考文献

第二章表达体系的选择与构建

2.1 材料与仪器

2.1.1 菌株及质粒

2.1.2 试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 Escherichia coli工程菌的构建

2.2.2 Pichia pastoris工程菌的构建

2.2.3 免疫印迹(Western-Blot assay)鉴定

2.3 结果

2.3.1 E.coli工程菌的构建

2.3.2 P.pastoris工程菌的构建

2.4 讨论

小结

参考文献

第三章发酵条件的优化和Reteplase包涵体的制备

3.1 材料和仪器

3.1.1 试剂

3.1.2 仪器与设备

3.1.3 菌株

3.1.4 培养基

3.2 实验方法

3.2.1 摇瓶培养

3.2.2 发酵罐培养

3.2.3 包涵体洗涤

3.2.4 包涵体的溶解

3.2.5 超声波法辅助包涵体溶解

3.2.6 其他检测方法

3.3 结果

3.3.1 IPTG浓度的影响

3.3.2 诱导时间的确定

3.3.3 葡萄糖浓度对目的蛋白表达量的影响

3.3.4 诱导后提高培养温度

3.3.5 包涵体的表达及洗涤

3.3.6 包涵体溶解及超声波法辅助包涵体溶解

3.4 讨论

小结

参考文献

第四章 Reteplase体外复性的研究

4.1 材料与仪器

4.1.1 试剂

4.1.2 主要实验仪器

4.2 实验方法

4.2.1 稀释复性

4.2.2 PDI辅助蛋白复性

4.2.3 SEC辅助Reteplase蛋白复性

4.2.4 ETI亲和层析纯化Reteplase

4.2.5 其他分析方法

4.3 结果

4.3.1 稀释复性

4.3.2 PDI辅助蛋白复性

4.3.3 色谱法辅助复性

4.3.4 不同方法复性率的比较

4.3.5 ETI亲和层析纯化Reteplase

4.4 讨论

小结

参考文献

总结与展望

致谢

在读期间发表论文情况

学位论文评阅及答辩情况表

发布时间: 2007-07-19

参考文献

[1].多种基因工程体系表达人肝细胞生长因子的研究和评价及基因治疗的实验初探[D]. 常冰梅.山西医科大学2004
[2].嗜水气单胞菌中聚羟基脂肪酸酯包涵体蛋白PhaP的研究[D]. 田树君.中国农业大学2005

重组组织型纤溶酶原激活剂变异体（RETEPLASE）工程菌的培养与体外复性的研究

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