论文摘要
目的:骨创伤、骨肿瘤和畸形矫形导致的骨缺损是临床常见而又很棘手的问题,所以移植骨需求量很大,现有自体骨或同种异体骨移植等方法存在诸多局限性。组织工程为人们寻找新的骨修复替代材料提供了一条新的途径。组织工程是应用细胞生物学和工程学原理,将生长因子、种子细胞和支架材料在体外整合在一起然后移植到人体内所需要的部位,从而达到器官修复或再造治疗目的一种技术。本研究选择骨诱导活性蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)家族中活性最强的诱导成骨因子BMP2(Bone Morphogenetic Protein-2,BMP2)。到目前为止,BMP2在原核细胞中的表达的报道仍存在一些不足。例如,在大肠杆菌中表达真核蛋白,不能进行翻译后修饰,诸如不能完成蛋白的糖基化、磷酸化和二硫键的形成等,所以不易制得具备天然活性的蛋白质。真核细胞能够表达具有生物功能的BMP2,但存在体内细胞很难定位的问题。本研究构建携带有BMP2基因的绿色荧光蛋白表达载体,即可以实现在真核细胞中表达BMP2,又可以达到体内示踪定位目的,为后期骨组织工程动物试验奠定基础。方法:依据Genbank中hBMP-2序列化学合成两条引物,在目的基因的5’端非翻译区添加限制性内切酶BamHI位点和Kozak序列,Kozak序列可以增强核蛋白体小亚基与mRNA起始位点的结合,和在其3’端添加双终止密码子和限制性内切酶NheI位点。上下游酶切位点均加入保护性碱基。有学者认为,在大肠杆菌E.coli中编码hBMP-2羧基端不同长短的氨基酸肽段的hBMP-2 cDNA表达,具不同程度的诱导成骨活性,而且愈接近成熟肽长度活性愈高。因此,克隆其全长成为必需。为后期组织工程的临床应用需要,保持BMP2蛋白的分泌功能,本文成功地克隆了完整编码区人BMP-2信号肽、前肽和成熟肽基因。本实验克隆人BMP2 cDNA全长(含有69个信号肽序列、726个前肽序列,342个成熟肽序列,和形成二硫键必需的半胱氨酸(Cys))。在已有全长型人BMP2重组哺乳类表达载体pcDNA3.1/CT-hBMP2的基础上,以pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,运用PCR技术扩增得到重组hBMP-2全长片段,将其亚克隆构建成pTA2-hBMP2载体并转化大肠杆菌DH5α,提取重组质粒,酶切鉴定并测序。购买表达质粒转化大肠杆菌DH5α后提取重组质粒,表达质粒和重组子pTA2-hBMP2均用BamHI和NheI双酶切后回收DNA片段,将所得目的基因片段插入克隆载体pSELECT-GFP zeo-MCS并转化大肠杆菌DH5α后提取重组质粒,酶切鉴定并测序。按照LipofectmineTM2000 Reagent说明书将上述空环状质粒表达载体和重组表达载体分别转入转染含5%胎牛血清的条件培养基DMEM中的COS7细胞中,48h后荧光显微镜观察,采用免疫荧光化学方法和Western Blotting鉴定。结果:经0.8%琼脂糖电泳显示:PCR产物为一长约1216bp的带。将其连接线型T-easy克隆载体,阳性克隆质粒经双酶切可得约1216bp的片段,测序证实与Genbank中的序列完全相符。重组表达载体pSELECT-GFP zeo-hBMP2经双酶切酶切可得约1216bp的片段,测序证实与Genbank中的序列完全相符。重组表达载体转染COS7细胞后48h荧光显微镜证实转染成功,免疫荧光化学证实BMP2可在真核细胞中表达。Western Blotting亦证实重组蛋白有免疫原性,完整肽分子量大小在45kD左右。结论:本次研究成功构建含有增强型绿色荧光蛋白基因的BMP2真核表达载体,能够在真核细胞中表达分泌BMP2改善骨缺损部位的微环境,表达载体具有绿色荧光标记,为研究hBMP2的体内示踪定位提供了一个重要而方便的工具,已为下一步转染间充质干细胞及开展动物实验奠定基础,并为组织工程临床应用打下物质基础。