1，3-丙二醇产生菌的选育及其发酵研究

论文摘要

1,3-丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一,其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1,3-丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法。微生物转化法生产1,3-丙二醇具有显著的优点,成为当前的研究热点。本研究以产1,3-丙二醇（1,3-PD）克雷伯氏杆菌（Klebsiella sp.）为出发菌株,采用紫外诱变,结合0.5mg/mL亚硝基胍和超声波（200W,50kHz, 20min）复合诱变选育获得一株1,3-丙二醇高产突变株。在批次发酵中,该突变株产1,3-丙二醇能力提高36.72%,达23.31g/L。变异株经10次传代培养,发酵能力稳定。突变株副产物乙醇产量降低,副产物乙酸产量略有增加。酶量未发现有明显变化,甘油脱水酶活性提高约21%,1,3-PD氧化还原酶活性有所提高。采用单因素实验初步优化Klebsiella sp.突变株产1,3-丙二醇发酵工艺,分别考察了不同浓度的甘油、磷酸二氢钾、酵母膏等因素对Klebsiella sp.突变株发酵的影响。通过正交实验进一步优化了Klebsiella sp.突变株发酵培养基,其适宜组成为:甘油60 g/L、磷酸二氢钾3 g/L、酵母膏6 g/L、七水硫酸镁1 g/L。在摇瓶发酵中,1,3-丙二醇的产量达到27.03 g/L,比优化前提高了约9.92 %。探讨了外源添加（VC、GSH、Cys、DTT）还原剂对Klebsiella sp.突变株合成1,3-丙二醇影响。添加0.35 mmol/L DTT、0.35 mmol/L Cys、0.45mmol/L GSH,1,3-PD的产量分别能达到29.77 g/L、29.32 g/L、29.87 g/L,均高于参照27.01 g/L。考察外源添加VC发酵过程变化,添加0.25 mmol/L的VC对1,3-PD的产量影响最大,达30.01 g/L较对照提高11.11 %;VC添加提高了副产物乙酸、乙醇浓度,添加0.25 mmol/L副产物乙酸、乙醇分别较对照提高3.77%、3.35%;添加VC对菌体生长有抑制作用,单位菌体产1,3-PD效率提高。考察添加ATP对Klebsiella sp.突变株合成1,3-PD的影响。结果表明:添加ATP对菌体生长有明显抑制作用,添加0.04 g/L的ATP对菌体抑制作用最大,较对照降低了26.5%。添加0.06 g/L ATP 1,3-PD终浓度较参照提高11.26%,达30.05 g/L。添加ATP提高单位细胞催化效率。添加ATP促进副产物乙酸的合成,添加0.06 g/L ATP ,发酵结束,乙酸浓度较对照高8.7%。在发酵的不同阶段（0h、4h、18h）,分别向3组摇瓶添加相同浓度（0.06g/L）ATP, 4h添加ATP 1,3-PD终浓度最高,达30.13 g/L,较对照提高11.26%。0h添加ATP的摇瓶1,3-PD/OD值最大,较对照提高25.84%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 1,3-丙二醇理化性质
• 1.2 1,3-丙二醇功能和应用
• 1.3 1,3-丙二醇的生产及市场概况
• 1.4 1,3-丙二醇制备方法
• 1.4.1 环氧乙烷羰基化法
• 1.4.2 丙烯醛水合法
• 1.4.3 微生物转化法
• 1.5 微生物发酵法生产1,3-丙二醇的研究进展
• 1.5.1 生产菌种
• 1.5.2 1,3-丙二醇生物合成途径
• 1.5.3 1,3-丙二醇生物合成途径中的关键酶
• 1.6 发酵工艺开发与优化研究
• 1.6.1 菌种筛选
• 1.6.2 培养基优化
• 1.6.3 培养条件
• 1.6.4 培养方式
• 1.7 产1,3-丙二醇基因工程菌的研究
• 1.8 生物法合成1,3-丙二醇研究现状
• 1.9 立题背景及意义
• 1.10 课题研究内容
• 第二章 1,3-丙二醇产生菌的诱变选育
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 培养方法
• 2.1.4 分析方法
• 2.1.5 诱变方法
• 2.1.6 酶活测定方法
• 2.1.7 SDS-PAGE 电泳方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 出发菌株生长曲线
• 2.2.2 紫外诱变致死率选择
• 2.2.3 紫外诱变初筛
• 2.2.4 紫外诱变复筛
• 2.2.5 复合诱变条件
• 2.2.6 复合诱变复筛
• 2.2.7 产量性状稳定性实验
• 2.2.8 上罐实验
• 2.2.9 出发菌株和突变株全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析
• 2.2.10 出发菌株和突变株还原途径酶活性变化
• 2.3 本章小结
• 第三章 KLEBSIELLA SP.突变株发酵产1,3-丙二醇培养基优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 培养方法
• 3.1.4 分析方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 初始甘油浓度对突变株发酵的影响
• 12 浓度对突变株的影响'>3.2.2 维生素B₁₂浓度对突变株的影响
• 3.2.3 磷酸二氢钾浓度对突变株发酵的影响
• 3.2.4 酵母膏浓度对突变株发酵的影响
• 3.2.5 硫酸镁的浓度对突变株发酵的影响
• 3.2.6 柠檬酸的浓度对突变株发酵的影响
• 3.2.7 正交优化实验结果与分析
• 3.2.8 Klebsiella sp.突变株优化培养基前后发酵特性
• 3.3 本章小结
• 第四章 添加辅助因子对 KLEBSIELLA SP.突变株产1,3-丙二醇的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 培养方法
• 4.1.4 分析方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 不同还原剂对1,3-丙二醇合成的影响
• 4.2.2 维生素C 对1,3-PD 合成及菌体生长影响
• 4.2.3 维生素C 对副产物合成的影响
• 4.2.4 发酵初期添加ATP 对1,3-PD 合成及菌体生长影响
• 4.2.5 发酵初期添加ATP 对副产物合成的影响
• 4.2.6 发酵不同阶段添加ATP 对1,3-PD 合成及菌体生长影响
• 4.3 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 课题展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文