三叶半夏病毒病和细菌病的鉴定、检测和侵染特性及脱毒组培研究

论文摘要

三叶半夏（Pinellia ternata（Thunb）Breit）是天南星科（Araceae）三叶半夏属（Pinellia）多年生草本植物。其干燥块茎为常用中药材之一，已有2000多年的用药历史。三叶半夏主要产于长江流域各省以及东北、华北等省区。在558种中药处方中，三叶半夏列为第22位使用频率最高的药材。由于野生资源的日益减少，许多地方开始采用人工栽培的方法进行三叶半夏种植。但在三叶半夏栽培区中病毒病和软腐病导致了三叶半夏种质逐年下降甚至绝收。本研究对侵染三叶半夏的病毒和细菌进行了鉴定。对病原物的侵染特性、检测技术和三叶半夏脱毒组织培养技术体系进行了探讨。一、三叶半夏病毒病研究1、病毒鉴定：三叶半夏病株呈斑驳、典型花叶、皱缩、叶片变小、沿脉变色、植株矮化及畸形等症状。电镜显示有两种病毒粒体，一种为直径35nm的球形病毒粒子和长度为750nm的线状病毒粒子。病毒复制期间的双链RNA提取和电泳检查、RT-PCR和ELISA检测结果表明它们分属于黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus）。2、三叶半夏带毒率调查：经ELISA法检测，来自浙江宁波、浙江萧山、河北、安徽、四川南充、北京、江苏丰县七个地区的栽培三叶半夏的CMV检出率分别为75％、100％、63％、30％、5％、0％和30％；SMV检出率分别为35％、30％、40％、25％、0％、25％和30％；复合检出率分别为25％，10％，20％，25％，0％，0％和5％。来自全国各地的25份野生三叶半夏样品中，CMV、SMV，以及复合检出率分别为：20％，20％和16％。检测结果表明，CMV和SMV在栽培的和野生的三叶半夏中均存在，但野生三叶半夏的带毒率明显低于栽培三叶半夏。3、病毒侵染三叶半夏的特性：侵染三叶半夏的CMV不能通过摩擦接种感染三叶半夏和普通烟、苋色黎、昆诺藜和克氏烟；而CMV的番茄分离物和普通烟的分离物可以摩擦接种感染三叶半夏。同时来源于三叶半夏和大豆的大豆花叶病毒均可以摩擦接种三叶半夏无毒苗。二、三叶半夏软腐病研究1、病原鉴定：软腐症状常常表现在人工栽培的三叶半夏块茎上，在高温高湿条件下则可能导致叶面腐烂和整株死亡。从已软腐病株分离到10个细菌菌株，定名为RF1～RF10，对这些菌株进行了致病性鉴定、电镜观察、细菌学性状测定和生理生化鉴定，并对RF1进行了分子鉴定。结果表明，这10个菌株均可导致三叶半夏、胡萝卜、土豆、番茄、黄瓜和白菜软腐。病原细菌在电镜下呈两端钝圆的短杆菌，4-6根周生鞭毛，兼性厌氧、革兰氏阴性，其DNA的G+C摩尔比为51％。RF1菌株的16S rDNA基因测序和系统发育学分析表明其与胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum）M1菌株报告的序列完全相同，与E161菌株和441菌株的序列相似度达97～98.5％。结果表明三叶半夏软腐病原菌应属于胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种（P carotovorum subsp．carotovorum）2、病原细菌的胞外酶检测：在接种胡萝卜软腐果胶菌RF1后24小时，三叶半夏小植株的细胞提取液中果胶酶的活性较对照组提高8倍；蛋白酶的活性较对照组提高12倍以上，而纤维素酶活性近乎为0。在对RF1的离体培养过程中同样检测到了较高的果胶酶和蛋白酶活性。三、三叶半夏组培脱毒研究1、组培污染菌的鉴定和消除：分离到3株导致三叶半夏组培物污染的芽孢杆菌。经形态学和生理生化试验，鉴定为环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。在含30mg／L的青霉素或30mg／L的氨苄青霉素的培养基内连续继代3次可以消除细菌的污染，同时不影响瓶苗的生长。2、三叶半夏组培苗病毒检测技术比较：以三叶半夏18S rDNA基因为内参照，对携带CMV的三叶半夏组培苗的各部分进行了相对定量Real Time PCR检测，并以ELISA和RT-PCR检测结果相比较。结果证实，来自CMV阳性母株的组培苗叶片中的病毒浓度较块茎和愈伤组织中的高；组培苗的CMV浓度较母株大大降低。ELISA方法在对组培苗中含有的超低浓度的病毒进行检测时可能出现假阴性结果；RT-PCR方法灵敏度更高，但不能精确量化病毒的浓度。而Real Time PCR方法具有更好的精确度和量化性。试验结果还提示我们在组培过程中病毒浓度随着扩繁的进行而下降，进行脱毒组培时应该选取Real Time PCR等灵敏度更高的检测方法。3、通过茎尖脱毒技术得到的三叶半夏组培丛生芽可以稳定继代20次。合适的继代周期为20天。大田生长速度对比试验的结果表明，脱毒组培苗的块茎增重速度较带毒非组培块茎高25％。不外加任何处理使生根苗自然倒苗形成离体小块茎直接用于大田播种时成活率近100％。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 三叶半夏组织培养研究进展
• 1.1 三叶半夏的品种及产地
• 1.2 三叶半夏组织培养技术研究进展
• 2 脱病毒组织培养技术研究进展
• 2.1 热处理脱毒法
• 2.2 愈伤组织培养法
• 2.3 原生质体培养法
• 2.4 珠心胚培养法
• 2.5 花药培养法
• 2.6 微型嫁接脱毒
• 2.7 茎尖分生组织培养法
• 2.8 不定芽再生脱毒
• 3 植物病毒检测方法概述
• 3.1 寄主生物学测定法
• 3.2 细胞病理学方法
• 3.3 电镜观察方法
• 3.4 血清学方法
• 3.5 病毒dsRNA分析
• 3.6 PCR和 RT-PCR技术
• 3.7 核酸杂交方法
• 3.8 基因芯片方法
• 3.9 异源双链泳动分析法
• 4 侵染三叶半夏的病原微生物研究进展
• 4.1 侵染三叶半夏及天南星科植物的病毒
• 4.2 细菌性软腐病研究进展以及侵染三叶半夏的病原细菌
• 第二章 三叶半夏病毒的检测研究
• 1 材料与方法
• 1.1 三叶半夏块茎采集与保存
• 1.2 野生和人工栽培三叶半夏植株发病情况统计
• 1.3 侵染三叶半夏的病毒的检测
• 1.3.1 病毒粒子检查及感病植物的组织病变观察
• 1.3.2 病毒双链 RNA（dsRNA）提取与病毒基因组分分析
• 1.3.3 RT-PCR方法检测 SMV和 CMV
• 1.3.4 DAS-ELISA方法检测 SMV和 CMV
• 1.4 三叶半夏病毒寄主反应的测定
• 1.4.1 CMV的寄主反应性测定
• 1.4.2 SMV的寄主反应性测定
• 1.5 侵染三叶半夏的病毒的调查
• 1.5.1 野生和人工栽培三叶半夏植株发病情况统计
• 1.5.3 野生和人工栽培三叶半夏植株病毒检测
• 2 结果及分析
• 2.1 三叶半夏受病毒侵染的田间症状
• 2.2 三叶半夏病毒粒子及组织病变观察结果
• 2.3 侵染三叶半夏病毒dSRNA检测结果
• 2.4 RT-PCR和 DAS-ELISA方法检测三叶半夏病毒的结果比较与分析
• 2.5 三叶半夏病毒寄主反应的测定
• 2.5.1 侵染三叶半夏的CMV的寄主反应性测定结果
• 2.5.2 不同来源的SMV侵染三叶半夏的的寄主反应性测定结果
• 2.6 侵染三叶半夏的病毒的调查结果
• 2.6.1 野生和人工栽培三叶半夏植株发病情况统计结果
• 2.6.2 不同地区的栽培三叶半夏的CMV和 SMV的血清学检测结果
• 2.6.3 不同地区的野生三叶半夏的CMV和 SMV检测结果
• 3 讨论
• 第三章 三叶半夏细菌性软腐病病原菌的分离、分子鉴定和致病性测定
• 1 材料与方法
• 1.1 三叶半夏软腐病原菌的分离及纯化
• 1.2 致病性测定和病原菌的重新分离
• 1.3 三叶半夏软腐病原菌的形态鉴定
• 1.3.1 菌落形态观察
• 1.3.2 革兰氏染色
• 1.3.3 扫描电镜观察
• 1.4 生理生化反应鉴定
• 1.4.1 接触酶试验
• 1.4.2 氧化酶试验
• 1.4.3 糖发酵试验
• 1.4.4 尿素酶试验
• 1.4.5 结晶紫果胶试验
• 1.4.6 柠檬酸盐试验
• 1.4.7 苯丙氨酸脱氨酶试验
• 1.4.8 硫化氢试验
• 1.4.9 明胶液化试验
• 1.4.10 硝酸盐还原试验
• 1.4.11 甲基红（Methyl Red）试验
• 1.4.12 VP试验
• 1.4.13 吲哚试验
• 1.4.14 淀粉水解试验
• 1.5 DNA的G+C mol%测定
• 1.5.1 DNA提纯
• 1.5.2 Tm值测定
• 1.6 16SrDNA片段的扩增和序列分析
• 1.6.1 软腐菌基因组DNA的提取
• 1.6.2 16SrDNA片段的扩增
• 1.6.3 PCR产物（目的片段）的克隆测序
• 1.7 三叶半夏细菌性软腐病病原菌致腐特性研究
• 1.7.1 试剂及配制
• 1.7.2 三叶半夏苗酶提取液制备
• 1.7.3 果胶酶活性的测定
• 1.7.3.1 半乳糖醛酸标准曲线制作
• 1.7.3.2 酶活测定
• 1.7.4 纤维素酶活性的测定
• 1.7.4.1 葡萄糖标准曲线制作
• 1.7.4.2 纤维素酶（滤纸酶）活性测定
• 1.7.5 蛋白酶活性测定
• 1.7.5.1 标准曲线制作
• 1.7.5.2 样品酶活测定
• 1.7.6 软腐果胶菌RF1离体条件下产胞外酶活性的测定
• 2 结果及分析
• 2.1 三叶半夏软腐菌的分离与回接试验结果
• 2.2 RF系列菌株的形态观察、生理生化分析
• 2.3 RF1的16SrDNA序列测定分析结果
• 2.4 样品的酶提取液果胶酶活性测定结果
• 2.5 样品的酶提取液纤维素酶活性测定结果
• 2.5.1 葡萄糖标准曲线的制作
• 2.6 蛋白酶活性测定结果
• 2.6.2 蛋白酶活性的测定结果
• 2.7 离体条件下RF1的胞外蛋白酶、纤维素酶和果胶酶测定结果
• 3 讨论
• 第四章 三叶半夏脱毒组培研究
• 1 材料与方法
• 1.1 带病毒三叶半夏在组培过程中病毒含量的消长研究
• 1.1.1 主要仪器和试剂
• 1.1.2 引物和试验材料
• 1.1.2.1 PCR所用引物
• 1.1.2.2 试验材料
• 1.1.3 DAS-ELISA方法
• 1.1.3.1 样品制备
• 1.1.3.2 测定方法
• 1.1.4 常规RT-PCR方法
• 1.1.4.1 植物总RNA的提取
• 1.1.4.2 cDNA合成
• 1.1.4.3 PCR反应
• 1.1.5 REAL-TIME PCR方法
• 1.1.5.1 植物总RNA提取
• 1.1.5.2 总RNA中去除DNA
• 1.1.5.3 第一链cDNA的合成
• 1.1.5.4 PCR扩增
• 1.2 组培污染菌的鉴定及控制研究
• 1.2.1 供试材料
• 1.2.2 被污染组培苗的扫描电镜观察
• 1.2.3 三叶半夏组培污染菌的分离和鉴定
• 1.2.4 污染细菌的抗菌谱
• 1.2.5 抗生素对组培污染的控制效果研究
• 1.3 三叶半夏的脱毒组培苗的快繁研究
• 1.3.1 待试材料
• 1.3.2 三叶半夏组培培养基成分
• 1.3.3 组培生产流程研究
• 1.3.3.1 无菌丛生芽的扩繁
• 1.3.3.2 丛生芽传代数对芽体质量的影响
• 1.3.3.3 组培苗生根、炼苗及移栽
• 1.3.3.4 大田生长比较试验
• 1.3.4 离体块茎的形成及萌发试验
• 2 结果与分析
• 2.1 对带 CMV组培苗的检测结果
• 2.1.1 DAS-ELISA方法对样品含 CMV的测定结果
• 2.1.2 RT-PCR方法对样品含CMV的测定结果
• 2.1.3 Real-time PCR对样品含CMV的检测结果
• 2.2 三叶半夏组培污染菌鉴定及抗生素试验结果
• 2.2.1 污染三叶半夏组培苗的细菌分离纯化结果
• 2.2.1.1 三叶半夏组培污染菌形态特征
• 2.2.1.2 三叶半夏组培污染菌生理生化特征
• 2.2.2 组培污染苗扫描电镜观察结果
• 2.2.3 三叶半夏组培污染菌对抗生素的敏感性试验结果
• 2.2.4 抗生素对组培污染的控制效果试验结果
• 2.3 三叶半夏的脱毒组培苗的快繁研究结果
• 2.3.1 培养时间对三叶半夏丛生芽组培增重的影响结果
• 2.3.2 继代过程中丛生芽数量的变化
• 2.3.3 继代次数对生长状况的影响
• 2.3.4 三叶半夏组培苗生产流程
• 2.3.5 大田生长比较试验结果
• 2.3.6 三叶半夏离体块茎的形成及萌发试验结果
• 3 讨论及结论
• 3.1 有关组培苗的病毒检测
• 3.2 有关三叶半夏组培污染菌
• 3.3 有关三叶半夏的脱毒快繁技术
• 第五章 结论和讨论
• 1 主要结论和创新点
• 1.1 三叶半夏病毒病研究
• 1.1.1 病毒鉴定
• 1.1.2 三叶半夏带毒率调查
• 1.1.3 CMV和 SMV侵染三叶半夏的特性
• 1.2 三叶半夏软腐病研究
• 1.2.1 软腐病原鉴定
• 1.2.2 病原细菌的胞外酶检测
• 1.3 三叶半夏脱毒组培过程研究
• 1.3.1 组培污染菌的鉴定和消除
• 1.3.2 三叶半夏组培苗病毒检测技术比较
• 1.3.3 脱毒组培苗的快繁
• 2 下一步工作设想
• 参考文献
• 附件1 DAS-ELISA方法缓冲液的配制
• 附件2 MS培养基母液及激素母液的配制
• 附件3 双链RNA提取用试剂
• 附件4 缩写词表
• 作者简历
• 致谢