日本血吸虫性别差异表达基因的筛选及新基因的克隆分析

论文摘要

血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。血吸虫为吸虫中罕见的雌雄异体,性别的分化对血吸虫的发育及致病起着至关重要的作用。雌雄虫合抱是血吸虫雌虫发育成熟和产卵的关键,成熟雌虫所产生大量虫卵而引起肝脏病变是造成宿主主要病理损害和疾病再传播的前提。基于此本论文开展了日本血吸虫性别差异表达基因的筛选研究,并对部分差异表达新基因进行了克隆分析,以探索血吸虫性别发育的分子机理,开拓免疫预防新途径。应用抑制性消减杂交技术构建了日本血吸虫雄虫和雌虫的消减杂交文库。消减效率分析表明同源基因经过消减杂交后得到了有效扣除,消减效率较高;重组比率及插入片断长度分析结果表明雌虫消减文库的重组比率为92%,且85%的插入片断大于500bp;雄虫消减文库的重组比率为91%,且90%以上的插入片断大于500bp;对构建的日本血吸虫雌雄虫消减库随机挑选部分克隆测序,分别获得64条雌虫EST序列和62条雄虫EST序列。同源性搜索结果表明分别代表了45和48个日本血吸虫基因,雌虫和雄虫消减文库的冗余率分别为29.7%和22.6%;所测EST序列共有25条与12种血吸虫已知基因匹配,其中雌虫消减文库中与血吸虫已知基因高度同源的有日本血吸虫卵壳蛋白、卵黄铁蛋白Ferrtin-1、fs800等基因。雄虫消减文库与已知血吸虫基因高度同源的有肌动蛋白、原肌球蛋白等基因。这几种血吸虫基因已经被证实为性别差异表达基因,结果表明本研究所构建的日本血吸虫性别差异消减文库质量较高,可以用于性别差异表达基因的筛选研究。利用cDNA微阵列技术在整个基因组水平上对日本血吸虫性别差异表达基因进行筛选。从构建好的雌虫和雄虫两个消减文库中共挑选3072个克隆制成cDNA微阵列。芯片杂交后获得953个雌虫高表达和1014个雄虫高表达的基因克隆。其中855个克隆经测序分析代表297个单基因,雌雄虫分别为137个和160个。序列同源性搜索结果表明:297个单基因中,247个与已知EST有95%～100%同源性;雌虫所代表的137个单基因中,蛋白功能已知的血吸虫基因有18个,蛋白功能未知的血吸虫基因96个,与已知EST高度同源的基因13个,其它物种基因2个,没有同源性的新EST 8个。雄虫所代表的160个血吸虫单基因中,蛋白功能已知的血吸虫基因30个,蛋白功能未知的血吸虫基因109个,与已知EST高度同源的基因15个,其它物种基因1个,没有同源性的新EST 5个。从中选取7个非冗余的差异表达基因克隆,用实时定量PCR进行了验证,证明上述克隆确为血吸虫性别差异表达的基因克隆,与芯片杂交结果一致。所测EST编码蛋白的功能预测结果显示:雌虫消减文库中与已知血吸虫基因高度同源的有卵壳蛋白、卵黄铁蛋白、fs800、RXR受体、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L、过氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶等,提示多与血吸虫的产卵、能量代谢、转录调节及抗氧化反应相关。雄虫消减文库与已知血吸虫基因高度同源的有肌动蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白、胶原、22.6ku膜蛋白、23ku膜蛋白、钙蛋白酶、calponin、钙调蛋白、钙网蛋白、热激蛋白HSP60、HSP70、HSP90等。EST的编码蛋白功能预测结果提示这类基因多为虫体的结构蛋白与虫体运动相关蛋白,参与离子调节与信号转导、蛋白质的合成、转运及分解代谢等。应用RACE技术扩增了4个血吸虫全长新基因cDNA。并利用生物信息学分析工具对新基因编码蛋白的理化性质、跨膜结构、抗原位点进行了分析预测,对编码蛋白的保守功能域、结构位点及其同源性蛋白进行了搜索。结果显示雌虫高表达f2基因编码蛋白具有泛素和核糖体蛋白S30e的保守功能域。雄虫高表达cm3基因编码蛋白具有C2H2型锌指结构的保守功能域,cm4编码蛋白具有SPla/RYanodine receptor SPRY结构域。m1基因编码蛋白可能是一种血吸虫特有蛋白。对新基因生物学功能的深入研究,对于探索血吸虫性别发育的分子机制、开发高效候选疫苗和药物新靶标具有重要价值。

论文目录

摘要

前言

第一章日本血吸虫成虫性别消减文库的构建及分析

1 引言

2 材料和方法

2.1 实验动物

2.2 载体

2.3 主要试剂

2.4 主要仪器

2.5 日本血吸虫雌雄虫的收集

2.6 日本血吸虫雌雄虫总 RNA 的提取

2.7 日本血吸虫雌雄虫mRNA 的分离

2.8 消减杂交分组

2.9 雌雄虫消减cDNA 质粒文库的构建

2.9.1 雌雄虫及对照样品（人骨骼肌mRNA）cDNA 第一链的合成

2.9.2 雌雄虫及对照样品（人骨骼肌mRNA）cDNA 第二链的合成

2.9.3 雌雄虫及对照样品（人骨骼肌mRNA）双链cDNA 的 Rsa I 酶切

2.9.4 作为tester 的雌虫、雄虫及对照骨骼肌cDNA 的接头连接

2.9.5 接头连接效率分析

2.9.6 第一轮消减杂交

2.9.7 第二轮消减杂交

2.9.8 消减杂交所获cDNA 的第一轮 PCR 扩增

2.9.9 消减杂交cDNA 的第二轮巢式 PCR 扩增

2.9.10 消减效率的分析

2.9.11 消减杂交cDNA 的回收纯化

2.9.12 消减杂交cDNA 与载体的连接

2.9.13 连接产物的转化

2.10 消减 cDNA 质粒文库的重组比率及插入片段长度分析

2.11 消减cDNA 文库的冗余性

2.12 消减文库部分 EST 序列的生物信息学分析

3. 结果与分析

3.1 雌虫和雄虫总 RNA 提取

3.2 雌虫和雄虫mRNA 的纯化

3.3 雌虫、雄虫cDNA 及 Rsa I 酶切结果

3.4 接头连接效率

3.5 性别差异表达基因文库消减效率的分析

3.6 消减cDNA 质粒文库的重组比率及插入片段长度分析

3.7 消减文库的冗余性评价

3.8 消减文库部分 EST 序列的生物信息学分析

4 讨论

5 本章小结

第二章 cDNA微阵列技术分析日本血吸虫成虫性别差异基因表达谱

1 引言

2 材料和方法

2.1 实验动物

2.2 主要仪器和试剂

2.3 日本血吸虫雌雄虫的分离收集

2.4 用于芯片制备的消减杂交克隆的筛选

2.5 cDNA 微阵列的制作

2.6 芯片杂交实验

2.6.1 芯片预杂交

2.6.2 荧光标记探针（以下在冰浴中进行）

2.6.3 芯片杂交

2.6.4 洗片

2.7 芯片扫描及数据处理

2.8 差异表达基因杂交数据的在线分析

2.9 差异表达基因的测序和分析

2.10 性别差异表达基因的实时定量PCR验证

2.10.1 RNA 抽提

2.10.2 去除基因组 DNA

2.10.3 反转录

2.10.4 标准品的制备

2.10.5 实时定量 PCR

3 结果

3.1 cDNA 微阵列的构建

3.2 差异表达基因芯片杂交结果

3.3 基因芯片杂交数据的聚类分析

3.4 差异表达基因的测序及生物信息学分析

3.5 血吸虫性别差异表达基因的实时定量 PCR 验证

3.5.1 实时定量 PCR 的标准曲线的绘制

3.5.2 血吸虫性别差异表达基因的实时荧光定量 PCR 验证结果

4 讨论

5 本章小结

第三章日本血吸虫性别差异表达新基因全长cDNA 的克隆与分析

1 引言

2. 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 主要试剂和酶

2.3 主要仪器

2.4 目标基因的ESTs

2.5 RACE 引物

2.6 日本血吸虫雌雄虫的分离收集

2.7 总 RNA 的提取

2.8 3′和5′RACE 扩增基因全长cDNA

2.8.1 3′RACE

2.8.2 5′RACE

2.8.3 RACE 产物的测序及全长序列的拼接

2.9 新基因全长cDNA 的 RT-PCR 扩增、克隆及测序

2.10 新基因全长cDNA 编码蛋白的生物信息学分析

3 结果

3.1 4 个日本血吸虫性别差异表达新基因全长cDNA 的获得

3.2 差异表达新基因全长cDNA 序列的生物信息学分析

3.2.1 雌虫高表达的新基因 f2 的生物信息学分析

3.2.2 雄虫高表达的新基因cm3 cDNA 的生物信息学分析

3.2.3 雄虫高表达的新基因cm4 cDNA的生物信息学分析

3.2.4 雄虫高表达的新基因m1 cDNA的生物信息学分析

4 讨论

5 本章小结

结论

致谢

英文摘要

参考文献

附录

附录A 文献综述

附录B 质粒pGEM-T Easy 基因图谱

附录C 在学期间发表论文及参编著作

日本血吸虫性别差异表达基因的筛选及新基因的克隆分析

论文摘要

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