广西巴马小型猪活化素β_A、β_B亚基基因成熟肽序列的克隆及原核表达

论文摘要

活化素（activin，ACT）是转化生长因子β（TGF—β）超家族成员之一，是由两个β亚单位通过二硫键相连而形成的二聚体可溶性糖蛋白，主要功能是通过活化素（activin，ACT）／抑制素（inhibin，INH）系统，参与下丘脑-垂体—卵巢轴调控来调节哺乳动物生殖细胞的发育与成熟。另外，活化素对体内不同组织细胞如肝脏、肾脏及肌肉等还有着广泛的调节功能。本研究参照GenBank发表的猪活化素βA、βB基因序列，对每个基因分别设计两对特异性引物，分段扩增，然后拼接。以广西巴马小型猪发情母猪卵巢组织总RNA为模板，通过反向聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出相应的cDNA片段。扩增片段纯化后，连接到pMD18-T载体，转入DH5α细菌扩增，并测序。结果表明：扩增得到的activinβA基因序列为1472bp，几乎包含了整个编码序列；而扩增得到的activinβB为791bp，包含整个成熟肽及部分信号肽DNA序列。同源性比较发现，广西巴马小型猪activinβA、βB与GenBank报道的猪activinβA、βB基因序列的同源性分别达到99.8％和99.6％，与奶牛、马及人等物种activinβA、βB基因序列的同源性也达到了90％以上，说明克隆得到的activinβA、βB基因序列的正确性。测序结果发现activinβA有5处发生了单个碱基的突变：即编码序列的第391位、496位、640位、1267位及3’端调控序列上的一个碱基；activinβB有3个碱基发生了突变：即编码序列的第599位、732位及848位。根据activinβA、βB基因成熟肽序列，分别设计两对引物，并在上下游引物上分别设计BamHI和EcoRI酶切位点，扩增activinβA、βB基因的成熟肽序列。经BamHI和EcoRI酶切分别将各个成熟肽序列定向连接到原核表达载体pRSETA质粒上，构建ACT-pRSETA融合表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）LysS。ACT-pRSETA重组质粒经鉴定有正确的阅读框后，进行IPTG诱导表达ACT融合蛋白。经SDS-PAGE和Western Blotting分析，证明已成功地表达了activinβA、βB基因成熟肽序列的融合蛋白（各个片段的大小约为20KD），此融合蛋白以包涵体的形式表达，有较高的表达量。诱导条件优化发现，37℃下培养，IPTG诱导的浓度为1mM，诱导5-8h有较好的效果。本研究成功克隆了广西巴马小型猪ACT两个亚基基因的部分cDNA序列，并构建了重组ACT—pRSETA原核表达质粒，实现IPTG诱导表达，为进一步研究活化素的生物学功能及为活化素在生产实践上的应用奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 常用缩写词
• 第一章、活化素的研究进展
• 一、活化素的分类和结构
• 二、活化素的组织分布情况
• 三、ACT的分子生物学机制
• 四、ACT与生殖
• 五、Activin与肌肉生长的关系
• 六、ACT与脂肪的关系
• 七、ACT与疾病的关系
• 八、本研究的目的和意义
• 第二章 试验研究
• 一、材料
• 二、主要仪器
• 三、溶液与培养基的配制
• 四、试验一:广西巴马小型猪活化素cDNA的克隆与序列分析
• 五、试验二:广西巴马小型猪活化素（Activin）成熟肽融合蛋白的表达
• 六、结论
• 参考文献
• 致谢