犬瘟热病毒H蛋白基因片段的克隆与原核表达

论文摘要

犬瘟热病是由犬瘟热病毒（CDV）感染犬和其他食肉动物的多发性、致死性传染病。CDV属于副粘病毒科麻疹病毒属，为有囊膜的负链线性RNA病毒，基因组长约16kb。基因组中包括6个非重叠基因区。它们的编码基因按3′-5′端顺序依次为N-P-M-F-H-L系列。最新研究表明CDV融合蛋白（F）和血凝素（H）蛋白是宿主免疫系统的主要目的抗原，是产生中和抗体的重要抗原之一。核衣壳（N）蛋白是保守性较强的免疫原性蛋白，此外N蛋白上含有T细胞表位。H，F和N蛋白在犬瘟热的免疫预防方面起重要作用。根据发表的犬瘟热病毒vaccine strain毒株序列设计一对引物，以犬瘟热病毒vaccine strain株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板，做RT-PCR扩增出H基因的3′端大小为549bp的基因片段。扩增产物连接到pMD18-T载体中，转化大肠杆菌DH5a菌株，筛选氨苄青霉素抗性菌落，提取质粒经酶切鉴定、PCR分析，将检测阳性的重组质粒进行测序，结果显示获得的CDV疫苗株的序列，与Genbank中疫苗株株H基因同源性为100％。将重组质粒pMD18-H和表达载体pGEX-4T-1同时用EcoRI和SalI酶切后，构建成重组表达质粒pGEX-H，将重组质粒转化进宿主菌RosettaTM，中，在37℃1.0mM IPTG诱导下，H基因片段获得了表达，收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析检测，结果表明犬瘟热病毒H基因片断在大肠杆菌中能高效表达，并能被犬瘟热病毒阳性血清识别。经凝胶薄层扫描分析表达蛋白约占菌体蛋白总量的27.5％，表达的目的蛋白的分子量约为46KD。本研究旨在获得CDV H蛋白基因，将其克隆后在大肠杆菌中表达，获得大量易于纯化的H蛋白并对其功能进行研究，为研制基因工程疫苗和诊断试剂等打下理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一 犬瘟热病研究进展
• 1 犬瘟热病的发生与分布
• 2 病原学
• 3 流行病学
• 4 临床症状
• 5 致病机理及病理变化
• 6 免役防控研究
• 二 犬瘟热病毒检测方法的研究进展
• 1 CDV分离培养
• 2 动物回归试验
• 3 电镜诊断
• 4 包涵体检查
• 5 CDV特异性抗原的检测
• 6 CDV特异性抗体的检测
• 7 CDV特异性核酸的检测
• 研究内容
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介