拟南芥非特异性磷脂酶C4基因表达模式研究

论文摘要

甘油磷脂除了构成生物膜外,还参与细胞膜对蛋白质的识别和信号传导。脂质信号的产生由多种参与脂质信号的蛋白所控制,磷脂酶是其中重要的一种。这种酶通过活化状态的改变调节信号脂质分子的含量,以应对具体的生物或非生物环境的变化。目前发现拟南芥基因组中存在六个预测编码磷脂酶C的基因,分别命名为非特异性磷脂酶C1,C2,C3,C4,C5和C6基因（NPC1-6）。目前只有日本科学家Yuki Nakamura对NPC4基因有过研究,提出此基因的表达受磷营养缺乏的诱导。为深入了解AtNPC4基因在植物生长发育中的生物学功能,本文主要对拟南芥中非特异性磷脂酶C（4NPC4）基因的表达模式,利用RT-PCR技术和GUS组织化学染色方法,从转录水平和蛋白质水平进行了研究。主要结果如下:1.利用RT-PCR技术,从RNA水平探讨NPC4的表达规律取不同发育时期和不同组织器官进行RT-PCR分析,在RNA水平检测NPC4表达情况。结果发现:NPC4基因在成熟叶片中表达量比较高,在根、茎、花和种荚中表达非常微弱甚至不表达;在种子萌发早期（1到10天）几乎检测不到。该结果表明NPC4基因在发育早期不表达或非常微弱,主要在成熟叶片中表达,在幼嫩的组织器官中表达非常微弱。2.利用GUS组织化学染色,从蛋白质水平分析NPC4的表达规律克隆了NPC4基因启始密码子ATG上游的1379 bp启动子区,并用Gateway系统构建了启动子融合GUS报告基因的载体PKG。用农杆菌介导的花沾法转化野生型拟南芥,获得阳性转基因植株,然后进行GUS组织化学染色观察,在蛋白水平检测其表达情况。结果表明:早期发育阶段,植株没有染色,说明NPC4基因在生长发育中的组织和器官中表达很微弱甚至不表达;而在成熟的植株中,能观察到染色,说明该基因在成熟的组织器官中表达,尤其是叶片中表达量最高。这与RT-PCR技术检测的结果相一致。3.NPC4基因的诱导表达对野生型拟南芥用水杨酸（SA）﹑甲基茉莉酸（MeJ）和脱落酸（ABA）等外源活性物质处理,通过RT-PCR和GUS组织化学染色分析,都发现NPC4基因的表达受脱落酸（ABA）的诱导,但不受水杨酸（SA）、甲基茉莉酸（MeJ）的诱导。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 磷脂代谢
• 1.1.1 磷脂种类
• 1.1.2 甘油磷脂
• 1.2 磷脂信号
• 1.2.1 磷脂酸
• 1.2.2 二酰甘油
• 1.2.3 溶血磷脂和自由脂肪酸
• 1.3 磷脂酶的研究
• 1.4 磷脂酶C 的研究
• 1.5 叶绿体膜结构的合成
• 1.6 NPC4 基因研究现状及研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 载体
• 2.1.4 工具酶
• 2.1.5 测序及引物合成
• 2.1.6 试剂盒
• 2.1.7 分子量标准
• 2.1.8 化学试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 拟南芥的栽培
• 2.2.2 CTAB 法提取基因组DNA
• 2.2.3 简易拟南芥基因组DNA 提取
• 2.2.4 拟南芥RNA 提取（Trizol 法）
• 2.2.5 反转录（First strand cDNA synthesis Kit-,ReverTraAce-α-，TOYOBO）
• 2.2.6 RACE 获得基因的5’和3’端
• 2.2.7 启动子与GUS 融合载体构建
• 2.2.8 拟南芥转化（Floral Dipping 法）
• 2.2.9 转基因植株的筛选和鉴定
• 2.2.10 纯系转基因种子的获得
• 2.2.11 转化子的GUS 染色
• 2.2.12 RT-PCR 反应
• 2.2.13 不同胁迫处理后的表达模式
• 3 结果与分析
• 3.1 基因结构
• 3.2 基因表达模式
• 3.2.1 RT-PCR 检测NPC4 基因不同组织器官表达模式
• 3.2.2 发育不同时期NPC4 基因的表达模式
• 3.2.3 组织化学染色结果
• 3.3 不同胁迫处理后的表达模式
• 3.3.1 半定量PCR 结果
• 3.3.2 激素处理后的GUS 组织化学染色结果
• 4. 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文情况
• 附录