5-酮基阿维菌素基因工程菌的研究

论文摘要

阿维菌素（Avermectin）是由阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）产生的十六元大环内酯类抗生素。阿维菌素具有广谱、高效的抗寄生虫活性，对宿主不良反应极低，是目前理想的驱虫、杀虫药物。此外，以阿维菌素为原料，再进行化学合成可得到一系列的半合成阿维菌素。本论文利用分子生物学的方法，通过对阿维菌素生物合成基因aveF基因的失活，得到了产生5-酮阿维菌素的基因工程菌株，为化学合成新的阿维菌素衍生物提供了可利用的原料来源。此外，本论文还对阿维菌素生物合成基因簇中aveC基因的功能进行了探索。首先，根据文献报导的aveF基因及其上下游核苷酸序列，设计了PCR引物，并扩增出了含有aveF基因的1.8kb DNA片段。将该DNA片段连接到pMD18-T载体后，将1.5kb的安普霉素抗性基因插入到该片段aveF基因的SalI位点，然后再将该3.3kbDNA片段切出，插入到具有接合转移功能的链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒pHJL401的多克隆位点，得到重组质粒pPC5。将重组质粒pPC5通过接合转移导入到阿维链霉菌后，经过筛选对安普霉素具有抗性而对硫链丝菌素敏感的同源双交换菌株，得到了aveF基因失活了的基因工程菌株AV-F1。对基因重组菌株AV-F1的发酵产物分析表明，该重组菌株产生两个主要组分，分别是5-酮阿维菌素1和5-酮阿维菌素2，此外，还产生一个小组分为阿维菌素B1a。为了进一步探索aveC基因在阿维菌素生物合成过程中的作用，本论文采用插入抗性基因片段的方法将该基因失活，得到重组菌株AV-C24。该菌株只能产生少量的“2”组分，而不能产生“1”组分，表明aveC基因与“1”组分的生物合成有关，可能是参与了聚酮体链合成后的脱水闭环反应。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 阿维菌素概述
• 1.2 阿维菌素的安全性
• 1.3 阿维菌素的生物合成
• 1.3.1 阿维菌素的合成途径
• 1.3.2 阿维菌素生物合成的基因簇及有关酶
• 1.4 阿维菌素生产菌的遗传改良
• 1a,B_2a'>1.4.1 选择性生产阿维菌素B_1a,B_2a
• 1a,B_2a'>1.4.2 选择性产生5-酮阿维菌素B_1a,B_2a
• 2a的选择性产出'>1.4.3 阿维菌素B_2a的选择性产出
• 1.4.4 选择性产生6,8a-开环-6,8a-脱氧阿维菌素
• 1.4.5 选择性产生C25不同的新型阿维菌素
• 1.4.6 有毒化合物Oligomycin的去除
• 1.5 阿维菌素的结构改造
• 1.6 本研究的立题依据、目的与意义
• 1.6.1 研究背景
• 1.6.2 目的与意义
• 第二章 实验材料与方法
• 实验材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 溶液
• 2.1.5 主要仪器
• 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌质粒DNA小量提取
• 2.2.2 链霉菌总DNA的提取
• 2.2.3 大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备和DNA转化
• 2.2.4 DNA酶切和连接
• 2.2.5 DNA电泳和凝胶片段回收
• 2.2.6 PCR反应
• 2.2.7 接合转移及双交换菌株的筛选
• 2.2.8 发酵产物的提取及检测
• 第三章 实验结果与讨论
• 第一部分 5-酮阿维菌素基因工程菌的构建
• 3.1.1 构建5-酮阿维菌素基因工程菌的理论依据
• 3.1.2 插入失活质粒pPC5的构建
• 3.1.3 接合转移
• 3.1.4 双交换菌株的筛选
• 3.1.5 重组菌株发酵产物的HPLC分析
• 3.1.6 对重组菌株的验证
• 3.1.7 小结
• 第二部分 只产阿维菌素"2"组分的基因工程菌株的构建
• 3.2.1 插入失活质粒pMYS5的构建
• 3.2.2 接合转移
• 3.2.3 双交换菌株的筛选
• 3.2.4 重组菌株发酵产物的HPLC分析
• 3.2.5 对重组菌株的验证
• 3.2.6 小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录