论文摘要
高血压病是最常见的心血管疾病，常引起心、脑、肾等脏器的并发症，严重危害着人类的健康，因此关于高血压药物的研究越来越多。卡托普利等化学合成的血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）类降血压药能够快速降低血压，但是存在咳嗽、首剂低血压效应、皮疹等副作用，所以人们把眼光更多地转向了安全性更高的食源性ACEI活性肽。为开发具有降血压功能的ACEI活性肽，本研究以玉米黄粉（CGM）为原料，通过超声辅助蛋白酶水解的方法制备出天然的ACEI活性肽，然后用超滤的方法对酶解液进行分离纯化，并通过动物试验考察了体内降血压效果。本课题开展了以下研究：以FAPGG（N-[3一（2-furyl）acryloyl]-L-phenylalanylglycyl-glycine）作为底物，以酶标板替代比色皿，以酶标仪替代分光光度计，建立了一种体外快速检测血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）活性的方法--微量法（MA）。经验证，该方法的准确性及精密度良好，检测快速、操作简便、灵敏度高。既适合大规模的活性筛选工作，也能应用于实际生产中的质量控制。用超临界CO2脱除玉米黄粉中的油脂，脱除率接近90％，且脱脂后，酶解效果较处理前有所提高。测定了脱脂玉米黄粉的主要成分，其蛋白质、脂肪、水分、纤维、淀粉和灰分的含量分别为60．45％、0．43％、8．96％、1．62％、14．23％和0．21％。为了得到高活性、低苦味、低盐的降血压肽，分备用7种商业蛋白酶水解玉米黄粉。以酶解液的IC50值为指标，选定两种效果较优的蛋白酶（蛋白酶D和E）进一步优化酶解条件。分别对这两种蛋白酶进行单因素（酶解时间、底物浓度、加酶量、pH和反应温度）及响应面优化试验，确定了酶解效果最好的蛋白酶E。优化得到蛋白酶E酶解玉米黄粉的最优条件为：酶解时间40 min，温度50℃，pH 7．0，底物浓度1．75％，加酶量3％，该条件下酶解产物的IC50为0．259mg／mL，产品得率为28．75％。研究了蛋白质酶促水解制备活性多肽的反应机理，通过试验方法结合理论推导，建立了恒定温度下玉米黄粉可控水解动力学模型：V=as0exp（-bh）==（?）和DH=（?）。求得该体系的热力学和动力学常数为：k2=9．2732／min，kd=3．8758／min，Km=2．7222 g／L，Ks=72．7234 g／L，Ea=17．7936 kJ／mol，Ed=17．9691kJ／mol。动力学常数与温度的关系能较好地符合阿累尼乌斯关系式。验证试验表明，根据动力学模型得到的水解度的理论值与实际试验值基本吻合。因此，所建立的动力学模型可用于蛋白质酶解反应过程的模拟、热动力学常数的计算和生物反应器的设计。分别考察了脉冲超声预处理蛋白酶耦合酶解（PUPPE）、脉冲超声预处理玉米黄粉原料耦合酶解（PUPCE）和酶解过程中施加脉冲超声（PUAE）等三种超声处理方式对玉米黄粉酶解制备ACEI活性肽效果的影响。结果表明，三种方式都能有效地促进玉米黄粉的酶解，提高产物的ACE抑制活性，其中UPCE方式效果最好。该方式的最佳参数为：料液体积200mL，超声时间15 min，超声功率1000 W，超声料液初始温度50℃，脉冲超声工作间歇时间比2 s／1 s。与未超声的对照组相比，超声预处理原料后酶解产物的抑制活性提高了74．08％，生产效率提高了55．11％，蛋白转化率提高了55．06％，米氏常数Km降低了33．30％。这表明脉冲超声辅助酶解法是一种高效制各玉米黄粉ACEI肽的方法。对超声波强化玉米蛋白酶解反应的机理进行了初步的探讨。研究了不同参数超声波对蛋白酶活性以及玉米蛋白可降解性的作用效果。以荧光和紫外光谱为监测手段，研究玉米黄粉蛋白和中性蛋白酶经超声处理后的分子构象变化情况。结果表明，随着超声功率增高，荧光发射强度逐渐发生变化，但发射峰未发生明显变化；紫外吸收强度发生变化，但吸收峰也未发生明显变化。这说明酶和蛋白分子中的整体构象未发生明显变化，但生色基团残基的微环境发生了一定的变化。此时，蛋白酶活力和玉米蛋白的可降解性均发生了明显变化，这表明超声微扰了蛋白和酶的活性部位，活力的变化快于分子整体构象的变化，这是因为酶或蛋白的活性部位位于柔性较大的区域。超声处理没有破坏玉米蛋白和蛋白酶的分子结构和整体空间构象，可能通过改变分子活性部位的局部空间构象，提高了玉米蛋白的可降解性和蛋白酶的催化活性。酶解液依次通过截留分子量10kDa、8kDa、5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行分离纯化。以IC50和产品得率为指标，选择3kDa的超滤膜。选择喷雾干燥方式对玉米黄粉降血压肽进行干燥，主要工艺参数为进风温度170℃、出风温度75℃。对相对分子量<3 kDa的玉米黄粉水解物进行热稳定性、耐酸碱稳定性和抗肠道酶解能力等性能研究。结果表明，玉米黄粉水解物在不同温度、pH值条件下保存以及与肠道酶在体外作用后仍然保持较高活性。用相对分子量<3 kDa的玉米黄粉水解物分别以75、150和300 mg／kg·bw的剂量对原发性高血压大鼠（SHR）灌胃，SHR的血压明显下降。用玉米黄粉水解物对SHR大鼠进行21天连续灌胃，发现降血压效果稳定。灌胃试验结果证实，玉米黄粉水解物对高血压大鼠具有明显的降血压作用，对血压正常大鼠无降血压作用。
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标签：玉米黄粉论文; 活性肽论文; 脉沖超声辅助酶解论文; 降血压论文; 动力学模型论文;