论文摘要
研究目的:（1）观察微线体蛋白在弓形虫速殖子内的分布。（2）观察弓形虫微线体MIC3DNA疫苗的免疫保护效果。研究方法:（1）采用RT-PCR法从弓形虫RH株扩增出微线体分泌蛋白MIC3编码基因,亚克隆至真核表达载体,构建真核表达质粒pcDNA3-MIC3和绿色荧光表达质粒pEGFP-C2-MIC3。（2）利用脂质体转染法分别转染真核表达质粒pcDNA3-MIC3和pEGFP-C2-MIC3入体外培养的COS-7细胞,获得重组蛋白,并通过SDS-PAGE和Western-blot等方法鉴定其表达;以荧光蛋白EGFP为标志观察MIC3在真核细胞中的定位。（3）利用电穿孔法转染pEGFP-C2-MIC3入弓形虫体内,通过EGFP的表达示踪观察MIC3在虫体内的定位。（4）大量制备并纯化重组质粒pcDNA3-MIC3,采用肌肉注射法免疫小鼠后进行攻击感染,观察小鼠死亡时间、淋巴细胞转化率、特异血清抗体和脾淋巴细胞亚群中CD4+和CD8+比值等,以期阐明对机体免疫系统的影响。研究结果:（1）成功构建重组质粒的pcDNA3-MIC3和pEGFP-C2-MIC3,DNA序列测定结果表明将大小为1080bp的MIC3片段分别克隆到pcDNA3的HindⅢ/EcoRⅤ位点和pEGFP-C2的BgLⅡ/HindⅢ。（2）转染pcDNA3-MIC3入COS-7细胞表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳结果显示42KDa大小的条带,Western-blot和ELISA进一步证实MIC3蛋白具有免疫学活性。（3）脂质体法转染pEGFP-C2-MIC3入COS-7细胞表达后的MIC3-EGFP融合蛋白呈点状分布均匀地分布COS-7细胞的细胞质中并在核膜附近有强绿色荧光的聚集,聚集的形状象英文字母“C”,而在细胞核内和细胞膜上没有发现MIC3-EGFP融合蛋白的表达。通过电穿孔法转染pEGFP-C2-MIC3入弓形虫体内发现,荧光集中于虫体顶端,说明MIC3能够靶向虫体顶端细胞器。（4）DNA疫苗免疫动物显示,pcDNA3-MIC3能延长弓形虫RH株攻击感染的生存时间。同时,对免疫鼠研究发现,pcDNA3-MIC3能刺激机体产生较高水平的特异性抗体;pcDNA3-MIC3能使宿主脾细胞CD4+/CD8+比值下降,与对照组相比,P值均小于0.05。提示该DNA疫苗主要以CD8+的CTL细胞途径激发机体的抗弓形虫效应。结论:1成功构建了两个真核表达质粒pcDNA3-MIC3和pEGFP-C2-MIC32 pcDNA3-MIC3成功地转化入COS-7细胞,并获得真核表达的MIC3蛋白,经Western-blot和ELISA分析显示重组MIC3有特异性的免疫原性。3 pEGFP-C2-MIC3成功转染入COS-7细胞显示MIC3定位于真核细胞的细胞质,转染入弓形虫体内结果显示MIC3能能够靶向虫体顶端细胞器。4成功构建MIC3的DNA疫苗,动物结果显示其能延长弓形虫强毒株（RH株）攻击感染动物的生存时间,且主要以CD8+的CTL细胞途径激发机体的抗弓形虫效应。
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