水稻隐花色素基因（Cryptochrome）RNAi表达载体构建与转化水稻的研究

论文摘要

以载体pSPROK、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301及拟南芥基因内含子为材料,通过酶切连接首先构建了一个RNAi工程载体pSC1301-347。然而以pSC1301-347为工具,构建了有关水稻隐花色素基因Cryla、Crylb和Cry2的四个RNAi和两个反义RNA表达载体,分别是pSC1301-347-Cryla、pSC1301-347-Cry2、pSC1301-347-Crylab、pSC1301-347-Crylab2、pSC1301-347-antiCryla和pSC1301-347-anticry2,其中前四个为RNAi表达载体,最后两个为反义RNA表达载体。通过农杆菌介导法,用这些表达载体分别转化粳稻日本晴水稻,得到200多株不同克隆的Gus阳性植株。经测序分析与转基因植株分子检测证明构建的所有表达载体插入序列正确,目的基因片段均已完整地整合于水稻基因组序列。对T0代转基因植株的观察分析,初步认为:1.隐花色素基因对水稻结实率影响较大从已完成一个生命周期的4个RNAi转基因植株表现来看,植株均能正常抽穗开花,但基本不结实。pSC1301-347-Crylab2（V3）和pSC1301-347-Crylab（V9）未得到一粒种子,结实率为0;pSC1301-347-Cryla（V16）和pSC1301-347-Cry2（V19）个别植株得到少量种子。而对照日本晴结实率可达20%-30%。结实率低的原因,除冬天气候因素和转基因当代植株生长较为异常之外,推测是因为隐花色素基因被敲除或抑制后,水稻幼穗分化、减数分裂、花药开裂等某个或某些代谢过程发生障碍,导致最终不能形成正常有活力的雄蕊。2.子房膨大,不灌浆植株开花后,颖花或者空瘪,或者子房膨大不灌浆,内无淀粉等光合产物积累,只有水状的液态物质。pSC1301-347-Crylab2（V3）和pSC1301-347-Crylab（V9）两个载体的转基因植株尤其如此。推测在两个及两个以上的隐花色素基因表达受到抑制时,淀粉的生物合成或运输途径出现障碍。3.花药不正常雄蕊干瘪,颜色暗淡,花粉粒很少,不散粉。pSC1301-347-Crylab2（V3）和pSC1301-347-Crylab（V9）两个载体的转基因植株表现尤甚。推测cryptochrome基因可能参与水稻幼穗分化的某个生理生化代谢过程。4.植株形态上的差异在福州冬季光照不足的玻璃温室的环境条件下,pSC1301-347-Crylab2（V3）和pSC1301-347-Crylab（V9）转基因植株明显表现出一种病态:株高比pSC1301-347-Cryla（V16）和pSC1301-347-Cry2（V19）稍高,叶色发黄枯萎,叶片似长而软。5.对开花的影响pSC1301-347-Crylab2（V3）和pSC1301-347-Crylab（V9）转基因植株开花时间均比pSC1301-347-Cryla和pSC1301-347-Cry2要迟,因此cry基因与水稻开花有关,且抑制的基因数目越多,对开花似影响越大。以水稻成熟种子和幼嫩种子为材料,对水稻胚性愈伤诱导及其遗传转化进行了研究。结果表明,成熟种子、新鲜成熟种子及幼嫩种子愈伤诱导率均＞81%,平均86.67%,其中以新鲜成熟种子愈伤率最高,达96.887%;抗性愈伤率成熟胚为22.21%-40.71%,平均28.49%,幼胚为36.79%-43.21%,平均40%,幼胚的抗性愈伤率高于成熟胚;分化出苗率成熟胚为59.29%-80.43%,平均71.59%,幼胚为63.16%-72.73%,平均67.95%,幼胚与成熟胚差异不明显;转化率（Gus检测阳性率）成熟胚为43.07%-81.08%,平均61.59%,幼胚为58.33%-76.67%,平均67.50%,幼胚转化率稍高于成熟胚。不同载体抗性愈伤率、分化率与转化率存在一定的差异,表明插入的外源基因片段不同对抗性愈伤率、分化率与转化率有一定的影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 光受体
• 1.1 光敏素
• 1.2 蓝光受体
• 2 隐花色素的结构特征
• 3 隐花色素在植物中存在的普遍性
• 4 隐花色素基因的主要功能
• 4.1 隐花色素与植物光形态的建成
• 4.2 隐花色素与植物开花
• 4.3 隐花色素与植物生长
• 4.4 隐花色素与生物昼夜节律钟
• 4.5 隐花色素与信号转导
• 5 水稻隐花色素基因研究进展
• 6 本研究的主要内容与意义
• 第一章 水稻隐花色素基因RNAi及反义RNA表达载体构建
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.2 主要试剂与酶
• 1.2.3 主要仪器设备
• 1.2.4 PCR引物
• 1.2.5 培养基
• 1.2.6 实验方法
• 1.2.6.1 RNAi工程载体构建
• 1.2.6.2 RNAi及反义RNA表达载体构建
• 1.2.6.3 拟南芥基因组DNA提取
• 1.2.6.4 水稻叶片总RNA提取
• 1.2.6.5 大肠杆菌感受态的制备与转化
• 1.2.6.6 农杆菌感受态的制备与转化
• 1.2.6.7 细菌质粒DNA的提取
• 1.2.6.8 DNA与PCR产物的酶切连接及回收
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 RNAi工程载体分子鉴定
• 1.3.1.1 中间载体pSC1300的分子鉴定
• 1.3.1.2 工程载体pSC1300-347分子检测
• 1.3.1.2.1 拟南芥内含子的克隆鉴定
• 1.3.1.2.2 工程载体pSC1300-347酶切鉴定
• 1.3.1.2.3 pSC1300-347载体核心序列测序
• 1.3.1.2.4 pSC1301-347载体酶切鉴定
• 1.3.2 Cryla RNAi表达载体分子鉴定
• 1.3.2.1 Cryla基因片段的克隆与检测
• 1.3.2.2 pSC1301-347-cryla测序
• 1.3.3 Cry2 RNAi表达载体分子鉴定
• 1.3.3.1 Cry2基因片段的克隆
• 1.3.3.2 测序分析
• 1.3.4 双基因RNAi表达载体分子鉴定
• 1.3.4.1 基因片段的克隆
• 1.3.4.2 pSC1301-347-crylab载体测序
• 1.3.5 三个基因RNAi表达载体分子鉴定
• 1.3.5.1 Cry2基因片段的插入鉴定
• 1.3.5.2 pSC1301-347-crylab2载体左臂插入鉴定
• 1.3.5.3 pSC1301-347-crylab2载体测序
• 1.3.6 Cryla反义RNA表达载体分子鉴定
• 1.3.6.1 Cryla反义基因片段的克隆与转化子克隆的鉴定
• 1.3.6.2 pSC1301-347-anticryla载体测序
• 1.3.7 Cry2反义RNA表达载体分子鉴定
• 1.3.7.1 Cry2反义基因片段的克隆与鉴定
• 1.3.7.2 转化子克隆的鉴定
• 1.3.7.3 Cry2反义RNA表达载体测序
• 1.4 讨论
• 1.4.1 多个基因片段的连接
• 1.4.2 提高DNA片段连接效率
• 1.4.3 RNAi载体的测序
• 1.4.4 DNA序列的酶切检测
• 1.4.5 DNA连接产物的处理
• 1.5 结论
• 第二章 表达载体的遗传转化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 种子处理
• 2.2.4 接种与愈伤诱导培养
• 2.2.5 菌液制备
• 2.2.6 农杆菌侵染与共培养
• 2.2.7 抗性愈伤筛选与培养
• 2.2.8 分化与生根培养
• 2.2.9 移栽
• 2.2.10 统计方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 愈伤诱导
• 2.3.2 抗性愈伤筛选
• 2.3.3 分化率统计
• 2.4 小结与讨论
• 2.4.1 胚性愈伤的有效性问题
• 2.4.2 胚性愈伤诱导中外植体的选择
• 2.4.3 愈伤诱导过程中须注意的问题
• 2.4.4 分化与生根培养过程的简化
• 2.4.5 试验规模设计
• 第三章 转基因植株分子检测与表型分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 分化苗的Gus检测
• 3.2.2 转基因植株PCR分子检测引物
• 3.2.3 转基因植株基因组DNA提取
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 转基因植株的Gus检测
• 3.3.2 转基因植株DNA电泳检测
• 3.3.3 转基因植株PCR分子检测
• 3.3.4 转基因植株的表现
• 3.4 小结与讨论
• 0代整体表现评述'>3.4.1 RNAi转基因植株T₀代整体表现评述
• 3.4.2 cryl基因功能与cryla RNAi转基因植株的表现
• 3.4.3 CDy2基因功能与Cry2 RNAi转基因植株的表现
• 3.4.4 cryl与Cry2基因功能的互补性
• 3.5 后续工作
• 参考文献
• 附录1 六个表达载体测序峰图
• 附录2 学习期间主持参与的课题及发表的论文
• 附录3 部分缩写词注释
• 致谢