外源dsRNA抗甘蔗花叶病毒干扰调控研究

论文摘要

玉米（ZeamaysL.）是重要的粮食作物与饲料作物，也是现代蔬菜、食品、医药与化学工业的重要原料。然而，玉米病害尤其是玉米矮花叶病成了限制我国玉米产量与质量的重要因素。传统的育种方法由于抗性资源的匮乏及物种间的遗传隔离，使抗病育种工作受到了极大的限制。利用基因工程技术对玉米进行遗传改良，以增强玉米抗病虫与耐逆境能力，提高产量，改善品质，这成为玉米遗传育种的一个新方向。植物抗病毒基因工程的策略有多种，研究表明利用RNAi原理介导的抗病性特异性强，比较容易获得高抗甚至免疫的转基因植株，为作物抗病毒基因工程提供了更有效的途径。本文利用RT-PCR扩增甘蔗花叶病毒cp基因特异性干涉片段，构建原核表达载体LMCP，利用IPTG诱导表达，并对诱导条件进行优化，利用细菌表达的dsRNA提取液处理玉米植株，分析外源dsRNA抗SCMV的效果。结果表明：1、根据甘蔗花叶病毒cp基因序列设计特异性引物，RT-PCR扩增甘蔗花叶病毒cp基因上游及下游147bp和140bp的干涉片段。2、利用pUCCRNAi克隆载体构建甘蔗花叶病毒cp基因反向重复序列克隆载体pUCCRNAi+2F，再插入到原核表达载体L4440中，构建原核表达载体LMCP，转化大肠杆菌HT115。3、利用IPTG诱导并对诱导条件进行优化，结果表明，LMCP在大肠杆菌HT115（DE3）菌株中可表达产生预期大小的dsRNA片段。而且当IPTG浓度为0.40.6mmol/L，诱导4h左右时表达量最高。4、利用不同细菌表达的dsRNA提取液喷洒4叶期玉米植株，结果发现，LMCP1dsRNA及LMCP2dsRNA对甘蔗花叶病毒的干涉效果明显，而且LMCP1dsRNA的处理效果较LMCP2的好。5、通过对dsRNA的处理浓度、接种病毒的时间（持效期）、渗透性等参数进行优化。结果表明，外源dsRNA提取液对甘蔗花叶病毒具有免疫作用，当dsRNA稀释1/5以内时，对病毒侵染的干涉作用明显，当超过1/15时，处理效果大大下降。dsRNA喷洒后3d之内接种病毒，抗病效果明显，超过7d则不明显。另外，添加一定浓度的渗透剂有利于提高外源dsRNA的抗病效果。综上所述，本实验成功构建了表达载体LMCP，优化了诱导表达条件，并且建立了外源dsRNA调控甘蔗花叶病毒的技术体系，为玉米及其它植物病毒病的防治提供了依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 文献综述
• 1 玉米矮花叶病的基本概况
• 1.1 玉米矮花叶病的特性
• 1.1.1 分布及危害
• 1.1.2 病毒形态及株系划分
• 1.1.3 发病症状及寄主范围
• 1.1.4 玉米矮花叶病的传播
• 2 玉米矮花叶病防治方法
• 2.1 物理方法
• 2.2 化学方法
• 2.3 生物方法
• 3 RNAi技术及其在植物中应用
• 3.1 RNA干扰机理及应用
• 3.2 RNAi的特点外源
• 3.3 RNA沉默的机理
• 3.4 RNA干扰在植物抗病毒基因工程中的应用
• 3.4.1 RNA沉默与植物病毒
• 3.4.2 RNA干扰在植物抗病毒基因工程中的应用
• 3.4.3 外源dsRNA的抗病性研究
• 3.5 RNA干扰技术的相关问题
• 3.5.1 dsRNA的产生
• 3.5.2 dsRNA序列的选择
• 3.5.3 dsRNA的长度选择
• 3.5.4 dsRNA表达载体的构建
• 3.6 玉米抗病毒基因工程研究现状
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株质粒及主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 玉米叶片总RNA的提取、检测和反转录反应
• 1.2.2 甘蔗花叶病毒CP基因特异片段的RT-PCR扩增
• 1.2.3 PCR产物的回收纯化
• 1.2.4 RNA干涉原核表达载体LMCP的构建
• 1.2.5 dsRNA的体外诱导表达
• 1.2.6 诱导表达条件的优化
• 1.2.7 dsRNA的稳定性
• 1.2.8 外源dsRNA对玉米矮花叶病毒病的干扰效果
• 2 结果与分析
• 2.1 玉米叶片总RNA的提取
• 2.2 RNA干涉片段的制备
• 2.3 pUCCRNAi+F及pUCCRNAi+2F的构建
• 2.4 原核表达载体构建LMCP的建立
• 2.5 原核表达载体LMCPdsRNA的诱导表达
• 2.6 dsRNA诱导表达条件的优化
• 2.6.1 IPTG的浓度对诱导表达产物的影响
• 2.6.2 诱导时间对dsRNA表达量的影响
• 2.7 dsRNA的稳定性
• 2.7.1 不同缓冲液对dsRNA稳定性的影响
• 2.7.2 放置时间对dsRNA稳定性的影响
• 2.8 外源dsRNA抗甘蔗花叶病毒的干扰调控效果
• 2.8.1 不同细菌表达提取液对SCMV侵染的抑制效果
• 2.8.2 体外表达的dsRNA粗提液浓度对SCMV的干涉效果
• 2.8.3 不同接毒时间对SCMV的干扰效果
• 2.8.4 渗透剂处理对SCMV侵染的影响
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介