米诺地尔纳米脂质载体的制备及其体外经皮吸收研究

论文摘要

研究背景脱发（秃发）是临床常见的疾病,很多因素都会导致脱发。一般将脱发分为瘢痕性脱发和非瘢痕性脱发,而非瘢痕性脱发是最常见的,包括雄激素源性脱发和斑秃。仅拿雄激素源性脱发来说,有人做过一份调查：对北京、上海、广州、杭州等5个城市的5779名男士的调查中,雄激素性脱发的发病率达到25%。脱发的治疗方法很多,就外用药物治疗来说,大多数脱发以米诺地尔（Minoxidil, MDX）为首选外用药。特别是对于雄激素源性脱发,被推荐为一线外用药。该药最早是用于心血管内科的一种降压药,后来发现其有引起多毛的副作用故将其用于治疗脱毛。据文献报道其对毛发生长的作用归纳为以下六个方面：1.扩张毛细血管,增加局部血供。2.通过丝裂原效应直接刺激毛囊上皮细胞的增殖和分化。3.其硫酸盐是刺激毛发生长的活性代谢产物,能增加毛母质、毛外根鞘和毛周纤维细胞的合成代谢,延长毛发生长周期。4.该药为钾通道激活剂,能降低钙离子进入细胞；钙离子的存在及表皮生长因子可抑制毛囊生长。5促进毛乳头细胞表达VEGF,刺激毛发生长。Lachger报道米诺地尔可促进毛囊VEGFmRNA的表达。6.激活过氧化物酶PGHS,对毛囊细胞起保护作用。长期以来,米诺地尔酊剂是该药物的主要剂型,存在许多不足,譬如：1.酊剂易挥发,擦在皮肤外面易析出结晶,影响药物吸收；2.酊剂中的丙二醇、乙醇可引起皮肤过敏；3.药物皮内储留时间短,难以持续发挥疗效,且易透过皮肤,引起其他部位多毛、血压下降等副作用；4.乙醇有脱脂作用,可致局部皮肤干燥等,开发一种新型药物剂型,既能够延长药物疗效,又能够克服以上副作用就成了当务之急。由于米诺地尔酊剂的种种不足,使得其新剂型研究从未停止,从含丙二醇的酊剂到不含丙二醇的酊剂以及凝胶制剂、泡沫剂。虽然这些剂型确改善了原有酊剂在某些方面的不足,但由于没有从根本上改善药物在皮肤内的贮留量以及对毛囊的靶向性问题,都没有取代传统酊剂的应用。近年来,脂质体的研究成为新的热点,已正式上市的脂质体药物有十余种,但绝大多数都是口服制剂或者静脉制剂,极少有皮肤外用药物的商品。Mura S, Pirot F等人制备了米诺地尔囊泡脂质体,提出无乙醇配方的脂质体是一种很有前途的治疗脱发的方法,Hasanovic A, Hollick C曾考察了阿昔洛韦和米诺地尔两种阳离子脂质体,指出阳离子脂质体有着更好的稳定性和更好的皮肤扩散率。Jain B, Singh B认为中性脂质体能更好地运送药物到达毛囊皮脂腺。以上的研究主要是基于SLN （solid lipid nanoparticles）剂型的研究,该剂型稳定性较差,包封率较低,已经逐渐被新型脂质体所取代。纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers, NLC）是由固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles, SLN）发展而来的一种新型载药系统。它将液态脂质替代SLN中的部分固体脂质,通过形成含一定纳米隔室的脂质骨架,使纳米粒以结晶缺陷型或无定形结构存在,避免放置过程中药物外排导致的包封率降低,因而具有缓释控释作用,并且由于其主要通过毛囊吸收,特别适于经皮给药系统（transdermal drug delivery systems, TDDS）。我们以米诺地尔为主药,用硬脂酸、油酸、卵磷脂等脂质作为辅药,通过正交设计,确定药物的最佳配比,以溶剂扩散—低温固化法,制备米诺地尔纳米结构脂质载体（Minoxidil nanostructured lipid carriers）,并对其进行了性状考察、配方优化及体外透皮实验,拟开发一种高效、持久、低副作用的能够替代传统酊剂的米诺地尔新机型。目的和意义制备米诺地尔纳米结构脂质载体并进行配方优化以及与酊剂在体外进行透皮对比研究。通过以上研究,开发一种能够弥补原有酊剂不足又能够增加并且延长药效,减少毒副作用的剂型,具有广泛应用价值。方法Minoxidil-NLC制备：（1）将米诺地尔、硬脂酸、油酸、18烷酰胺溶于二氯甲烷；（2）取卵磷脂溶于乙醇。将步骤1和步骤2的所得物混合构成油相；（3）将苄泽溶于水,构成水相,在同温下,将油相缓慢加入水相,搅拌蒸发后加入同体积冰水中,超声10分钟通过0.45微米滤膜即得Minoxidil.-NLC.标准曲线的绘制：标准品溶液的制备精密称取米诺地尔20mg,置100mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,即得浓度为200μg·L-1的标准储备液。将标准品储备液用甲醇逐级稀释,得标准系列,浓度分别为100、50、25、10、5、1、0.5和0.1μg.mL-1.根据预实验结果,色谱条件为：Luna C18柱（150.0 mm×4.6 mm,5μm）；检测波长281nm；流动相：甲醇-水（30：70）,流速1.0 ml·min-1:柱温：30℃,进样量20μ1。以浓度（X）为横坐标,峰面积（Y）为纵坐标,得回归方程。用透射电镜对纳米粒的形态进行观察：用粒径分析仪检测纳米粒粒径大小和电位；用PH计测定纳米粒PH值,并检测药物有机物残留及观察药物稳定性。米诺地尔包封率检测：用高速离心法分离脂质体与游离药物,精密吸取米诺地尔-NLC 1.5 mL于离心管中离心,取全部上清液进样测试,即得游离药物含量W游。精密吸取1.5 mL米诺地尔-NLC于10mL量瓶中,甲醇定容,取样测试,即得1.5 mL米诺地尔-NLC总药物含量W总。按下式计算包封率（Entrapment Efficiency,EE%）:EE%=（W总一W游）／W总×100％正交试验根据预实验和包封率检测结果分析影响药物包封率的4个因素,即：A硬脂酸与卵磷脂的质量比、B固液脂质比、C药脂比、D乳化剂浓度。每个因素取三个水平用于测试各配方的包封率,优化配方。Franz扩散池体外透皮实验：皮肤透过实验：取SD大鼠腹部皮肤用打孔器制成直径22mm（有效内直径18mm）的皮肤样本（每只大鼠取2块）,置于扩散池,表皮面向供给池,接受液为PH=7.4的PBS溶液。不同供给池依次加入1mL米诺地尔纳米脂质载体、米诺地尔酊剂及空白对照纳米脂质载体。实验过程中保持37℃恒温,接受池中有磁力搅拌器搅拌,速度200r·min-1。分别在0.5、1、2、3、5、7、9、12h从接受池吸取400μL样本,同时立即补充相同体积的37℃恒温新鲜接受液。样本过滤后用HPLC测量峰面积。用Cr进行校正：Cr=Cn+V1∑Ci-1/V（i=1～n）。式中,C n为实测质量浓度,V1为取样体积,V为接受池容积。单位面积渗透量Q=CrV/A。以单位面积累计透过量（Q）对时间（t）进行线性回归,所得的斜率即为渗透速率常数Kp。皮肤中米诺地尔残留量的测定：经皮扩散12 h后,取下皮肤,用生理盐水洗去残留的制剂及接受液,用滤纸吸干,剪取扩散区域的皮肤,称重后剪碎,加入生理盐水1mL,匀浆,分次用无水乙醇（共3次,每次用1mL）提取皮肤中的米诺地尔,以10000 r·min-1低温离心30min并定容至3mL,用0.45μm微孔滤膜过滤后取10μL注入液相色谱仪,测定峰面积,代入标准曲线,计算药物在皮肤内的残留量皮肤刺激实验完整皮肤刺激试验：取豚鼠21只,体重（230.0±55.5）g,雌雄各半,随机分为三组,分别为0.5%米诺地尔酊剂组、0.5%米诺地尔纳米结构脂质载体组、空白脂质载体组,两侧背部去毛,次日涂药。面积（3×3）cm。24h后洗去药物,48后作肉眼观察,判断局部皮肤红斑情况。非完整皮肤刺激试验：另取豚鼠21只（同上）,在背部皮肤上用针头划“井”以刚刺破表皮为限,并涂药,48小时后观察。观察结束后,处死豚鼠解剖,观察各重要脏器病理改变。皮肤致敏试验：取健康豚鼠21只（同上）按文献方法,随机分为三组,分别为米诺地尔纳米结构脂质体组、米诺地尔酊剂组和2,4一二硝基氯代苯阳性对照组。将豚鼠脊柱两侧皮肤脱毛,每侧面积约3cm×3cm,每日两次涂药,分别于1d、7 d、14 d致敏3次,观察皮肤过敏反应,按文献标准评分,并计算致敏强度。按公式计算反应分值,反应分值=（红斑形成总分+水肿形成总分）/动物总数统计分析：以SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析,计量资料以X±S表示,正交设计用描述性分析,两组组间显著性检验用单因素方差分析,P<0.05时认为差异有统计学意义。结果制备的米诺地尔纳米结构脂质载体外观清澈无沉淀,有淡蓝色乳光。包封率为（86.89±6.26）%。平均粒径为（58.20±16.50）nm,Zeta电位为（23.15±2.60）mv,表明该脂质体带正电荷。PH值为4.03±0.23。电镜下纳米粒呈现椭圆形或圆形,分布较均匀。样品放置两个月后,冰箱内样品性状、粒径、包封率无明显变化,但室温下样品出现浑浊和少量沉淀。正交试验结果,在硬脂酸与卵磷脂比例为7：5、固液脂质比为1：3、药脂比为1：5、乳化剂浓度为0.045g/ml时获得最高包封率,为86.89%。二氯甲烷检测,5个批次的二氯甲烷残留量平均值为0.0035%MDX酊剂的药物透皮量随时间增加逐渐增加,而MDX-NLC药物的透皮量相对较少,透皮浓度上升缓慢,各个时间点均低于MDX酊剂。MDX酊剂渗透速率Kp（26.82士6.17μg.cm-2·h-1）比MDX-NLC的Kp（4.30±1.27μg·cm-2·h-1）高,经两独立样本t检验t=3.572,P<0.01,两组之间有显著统计学差异；透皮吸收12h之后,MDX-NLC药物组皮肤中药物贮留量为（99.73士9.85）μg·g-1,MDX酊剂组药物贮留量为（57.00士5.89）μg.g-1,两组比较有显著统计学差异（F=69.539,P<.01）。结论一、利用溶剂扩散法可以制备出粒径为58.20±16.50（nm）大小,包封率为（86.89±6.26）%,低温下性质稳定且有机溶剂残留量低的米诺地尔纳米脂质载体。二、米诺地尔纳米脂质载体与传统酊剂相比,具有渗透速率低、皮内贮留量高的特点。三、米诺地尔纳米脂质载体对豚鼠皮肤无刺激性、无致敏性。豚鼠的皮肤、心脏、肾脏、肺均未见病理改变。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 米诺地尔纳米脂质载体的制备
• 引言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 米诺地尔纳米脂质载体的体外透皮研究
• 引言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 英文缩写词对照表（Abbreviation）
• 综述
• 参考文献
• 成果
• 致谢
• 统计学证明