定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究

论文摘要

丙酮酸是生物细胞内EMP循环中的中间产物,不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用,而且是多种有用物质的前体。因此,它在化工、农药和农用化学品等工业及学科研究中有着广泛的用途。目前丙酮酸生产使用的大部分为光滑球拟酵母,多为硫胺素、生物素、吡哆醇、烟酸四种维生素营养缺陷型。该菌为条件致病菌,存在潜在的安全威胁,而通用来生产酒精的酿酒酵母耐性较强且公认为安全菌,因此本论文以酿酒酵母为研究对象,选育能积累丙酮酸的菌株。首先,以Saccharomyces cerevisiae Y2为出发菌株,把pdcl基因敲除片段（P1K）用电穿孔转化法转化到出发菌株S. cerevisiae Y2中,在含G418抗性的YEPD平板上筛选转化子,通过PCR和southern blot验证得到pdcl基因的敲除菌株S. cerevisiaeY2-1。然后,把pdc5基因敲除菌株敲除片段（P5H）用醋酸锂转化法转入到S. cerevisiaeY2-1中,在YNBG平板上筛选转化子,通过PCR和southern blot验证得到pdcl和pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15。最后,对其S. cerevisiae Y2-15的种子培养基、发酵培养基和发酵条件进行了优化。优化后的种子培养基为（g/L）：葡萄糖30,蛋白胨10,酵母粉5,KH2PO41, MgSO4·7H2O0.5,醋酸钠2,玉米浆0.5%,pH5.6。优化后的发酵培养基组成为（g/L）：葡萄糖80,蛋白胨20,酵母粉10,醋酸钠2.5,玉米浆1%,KH2PO41, MgSO4·7H2O0.5,金属离子母液5mL, pH5.6。优化后的发酵条件为：种龄26h、接种量12%,装液量70mL/250mL三角瓶。S. cerevisiae Y2-15优化后的丙酮酸的积累量为24.85g/L比优化前提高168%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 丙酮酸简介
• 1.2 丙酮酸（盐）及其衍生物的应用
• 1.2.1 在化工制药领域
• 1.2.2 在食品保健领域
• 1.2.3 其他方面的应用
• 1.3 丙酮酸（盐）的生产方法
• 1.3.1 化学催化合成法
• 1.3.2 生物催化法
• 1.3.3 微生物发酵法
• 1.4 发酵法生产丙酮酸研究现状及发展趋势
• 1.5 酿酒酵母代谢
• 1.5.1 酿酒酵母
• 1.5.2 酿酒酵母菌株改造
• 1.5.3 酿酒酵母的葡萄糖代谢
• 1.5.4 酿酒酵母的丙酮酸代谢
• 1.5.5 调节丙酮酸代谢节点上的代谢流量
• 1.6 酿酒酵母生产丙酮酸可行性分析
• 1.7 基因敲除
• 1.8 本课题立题依据及研究内容
• 1.8.1 立题依据
• 1.8.2 主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.1.4 培养基和溶液
• 2.2 分析方法
• 2.2.1 酿酒酵母细胞浓度测定
• 2.2.2 丙酮酸含量测定
• 2.2.3 葡萄糖浓度测定
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 酿酒酵母生长曲线的绘制
• 2.3.2 大肠杆菌质粒提取
• 2.3.3 质粒NotⅠ酶切
• 2.3.4 酶切片段回收
• 2.3.5 酿酒酵母的转化
• 2.3.6 酿酒酵母基因组提取
• 2.3.7 酿酒酵母丙酮酸脱羧酶活性测定
• 2.3.8 Southern blot
• 2.3.9 引物合成和PCR扩增
• 2.3.10 酿酒酵母的培养方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 酿酒酵母Y2的pdc1基因的敲除
• 3.1.1 酿酒酵母Y2生长曲线的测定
• 3.1.2 电击穿孔法转化酿酒酵母Y2
• 3.1.3 酿酒酵母转化子Y2-1的筛选与鉴定
• 3.1.4 转化子遗传稳定性
• 3.2 酿酒酵母Y2-1的pdc5基因的敲除
• 3.2.1 醋酸锂转化法转化酿酒酵母Y2-1
• 3.2.2 酿酒酵母转化子Y2-15的筛选和验证
• 3.2.3 转化子遗传稳定性
• 3.3 酿酒酵母丙酮酸脱羧酶活力测定
• 3.3.1 蛋白质浓度标准曲线
• 3.3.2 酿酒酵母Y2,Y2-1,和Y2-15丙酮酸脱羧酶活性比较
• 3.4 Southern blot验证酿酒酵母基因敲除菌株
• 3.4.1 酿酒酵母基因组酶切
• 3.4.2 探针的标记
• 3.4.3 杂交和检测
• 3.5 酿酒酵母发酵产酸实验
• 3.5.1 丙酮酸测定
• 3.5.2 摇瓶产酸实验
• 3.6 酿酒酵母Y2-15丙酮酸发酵的优化
• 3.6.1 Y2-15生长曲线的绘制
• 3.6.2 种子培养基的优化
• 3.6.3 发酵培养基的优化
• 3.6.4 发酵条件的优化
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢