奶牛子宫内膜抗菌肽分离纯化、BNBD5基因的克隆及原核表达

论文摘要

内源性抗微生物肽是生物体内先天性免疫的重要组成部分,防御素是广泛分布于动物和植物界的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗微生物肽,是内源性抗微生物肽中的一个大家族。是由生物细胞特定基因编码,经特定外界条件诱导产生的一类多肽。具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的作用。根据防御素分子内半胱氨酸的位置和连接方式、前体性质及表达位置的差异可分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆虫防御素和植物防御素五种类型,防御素主要分布于哺乳动物的黏膜上皮细胞内,所以,防御素被确认为黏膜表面抗微生物屏障的组成成分。在实验中以奶牛子宫为实验材料,从奶牛子宫内膜上皮组织中提取总RNA,根据已发表的牛抗菌肽基因序列设计引物。经RT-PCR扩增抗菌肽DNA片段,回收纯化PCR产物,连接pMD18-T载体,转化感受态细胞DH5a。在含X-Gal、Amp及IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经PCR及双酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明,RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为138bp,编码45个氨基酸的多肽,多肽中含6个保守半胱氨酸残基。用Blast程序进行检索比较,表明扩增序列与GenBank中发表的BNBD5编码区序列99.3%相同。利用DNAStar MegAlign分析了奶牛子宫内膜抗菌肽BNBD5与其他物种β-防御素5的ORF序列,得出奶牛BNBD5的cDNA与其他动物的β-防御素5的同源性。与山羊（Capra hircus,DQ532360）有80.4%的同源性,与小鼠（Mus musculus, NM030734）有56.5%的同源性,与褐鼠（Rattus norvegicus,NM001037549）有31.9%的同源性,而与冈比亚按蚊（Anopheles gambiae,EU273600）、中华蜜蜂（Apis cerana cerana,EU727272）和原鸡（Gallus gallus,AY621320、AY621307、DQ677636）的同源性均低于20%。这说明反刍动物的β防御素cDNA具有种属特异性。再以重组质粒为模板,用特异性表达引物扩增得到的基因:即编码BNBD5基因全长cDNA连接到原核表达载体pET28a中,构建的原核表达质粒pET- BNBD5,转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果表明:成功构建了pET28a-BNBD5载体,经IPTG的诱导, pET28a-BNBD5在原核内表达产物相对分子质量约为10ku,与预期融合蛋白大小一致,并以包涵体的形式存在,琼脂扩散实验检测表达产物的体外抑菌活性,在大肠杆菌中表达的奶牛子宫内膜抗菌肽的体外抑菌活性不太明显。本实验再以奶牛子宫为实验材料,刮取内膜上皮,用5%的冰乙酸抽提,通过酸性尿素聚丙烯酰胺电泳洗脱技术和反相高效液相色谱技术,分离纯化奶牛子宫黏液内源性抗菌肽,并进行其抗菌活性的检测。活性检测结果表明:在5min收集的样品没有抑菌圈出现,在45min收集的样品具有抗大肠杆菌BL21和金黄色葡萄球菌26003的活性。奶牛子宫内膜防御素的发现有利于对奶牛黏膜的防御机制进行进一步的研究,从而为奶牛子宫内膜炎防治奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 英文缩写词表
• 第一部分 文献综述
• 引言
• 1 抗菌肽的发现
• 2 抗菌肽的分类及结构特点
• 2.1 抗菌肽的分类
• 2.2 抗菌肽结构的一般特征
• 3 哺乳动物防御素的产生与分子构形特点
• 3.1 防御素的产生与分布
• 3.2 防御素的基本序列与结构
• 3.3 防御素cDNA 的结构和空间构像
• 4 哺乳动物防御素的生物学活性
• 4.1 防御素的生物学活性
• 4.2 抗菌肽的作用机制
• 4.3 影响抗菌肽的生物学活性的因素
• 5 防御素的基因表达与生物合成
• 5.1 基因表达与调控
• 5.2 生物合成
• 5.3 抗菌肽的基因工程
• 6 抗菌肽的人工进化、分子设计与人工合成
• 7 哺乳动物防御素在医学与农牧业上的应用前景
• 7.1 可成为合成抗生素的取代品
• 7.2 在转基因动植物上的应用
• 7.3 将在医学研究中发挥重要作用
• 8 国内抗菌肽研究开发现状
• 9 总结
• 第二部分 研究内容
• 第一章 奶牛子宫内膜抗菌肽BNBD5 基因的克隆
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 重组质粒的测序
• 2.4 序列分析
• 3 结果
• 3.1 BNBD5 基因PCR 扩增结果
• 3.2 重组质粒的PCR 鉴定结果
• 3.3 重组质粒的酶切及PCR 鉴定结果
• 3.4 重组质粒的测序结果
• 3.5 目的基因的基本性质分析
• 3.6 序列分析结果
• 4 讨论
• 4.1 奶牛子宫内膜抗菌肽BNBD5 的克隆
• 4.2 奶牛子宫内膜抗菌肽BNBD5 的分析
• 5 小结
• 第二章 奶牛子宫内膜抗菌肽BNBD5 基因的原核表达
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 BNBD5 基因片段的获得
• 3.2 重组表达载体的构建及鉴定
• 3.3 重组蛋白的诱导表达结果
• 3.4 重组载体PET- BNBD5 表达蛋白的分离纯化及体外活性的检测
• 4 讨论
• 4.1 影响外源基因在原核表达系统中表达的因素
• 4.2 PET-BNBD5 在大肠杆菌中的表达
• 4.3 超低分子量蛋白电泳结果影响因素
• 5 小结
• 第三章 奶牛子宫内膜抗菌肽的提取、分离纯化和鉴定
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果
• 3.1 子宫黏液酸溶性粗提物中抗菌多肽分析
• 3.2 反相高效液相色谱分离及Tricine-SDS-PACE 分析
• 3.3 收集各组分抗菌活性分析
• 4 讨论
• 4.1 抗菌肽的分离纯化方法
• 4.2 抗菌肽的抗菌机制
• 5 小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附图
• 附图1
• 附图2
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介