针对膜蛋白结构解析的核磁共振方法发展和应用

论文摘要

细胞膜为细胞构筑一道物质自由出入的屏障,保证胞内各种生化反应能在一个相对稳定的环境中有序运行。膜蛋白在胞内生命活动与周围环境发生信息、物质与能量交换过程中起着重要作用,但因样品稳定性及研究方法的限制,其结构和功能的研究进展缓慢。本论文主要目的就是发展优化膜蛋白样品制备和基于核磁共振的膜蛋白结构研究的方法。本文用两章分别对膜蛋白及核磁共振做简要描述。第一章中简要介绍膜蛋白的种类、功能以及结构研究现状。第二章介绍了核磁基本理论以及液体和固体核磁中常用于蛋白质结构和功能研究的一些方法,包括一些特殊的同位素标记技术。第三章中我们应用传统液体核磁共振和电子顺磁共振相结合的方法解析了一个结核分枝杆菌的“外膜蛋白”Rv0899的结构。之前的相关功能研究表明,Rv0899是一个外膜通道蛋白,从外界摄取诸如丝氨酸和葡萄糖一类的小分子水溶性营养物质,同时还对菌体适应外界酸性环境具有重要作用。但我们通过对其去垢剂和水溶液中的三维结构研究显示Rv0899只是以一个跨膜螺旋锚定在外膜上的单体蛋白,不太可能是一个分子通道。通过核磁滴定和等温量热滴定方法发现Rv0899可与Zn2+有较强的结合,所以我们推测Rv0899可能对Zn2+摄入有一定辅助作用。第四章中发展基于交叉极化原理的高效CA-CO重耦方法并应用到全标记的蛋白样品中。膜蛋白质在样品中与去垢剂或磷脂结合后总体分子量增大,在溶液中的运动速度减慢,弛豫速率增大,液体核磁方法很难检测到信号。固体核磁一般直接研究固态样品,不存在此类问题。但固体核磁发展起步较晚,还需发展更好的硬件和更多适用于蛋白质研究的脉冲程序。基于交叉极化原理的高效CA-CO重耦方法传递效率在CO和CA原子感受到的有效磁场之和等于两倍样品转速时达到最大。经过优化,此方法使得CO和CA之间的传递效率超过30%,比之前常用的自旋扩散方法高出70%左右。我们将其应用到具体的实验中,发展出一套完整的用于蛋白质主链归属的二维和三维固体核磁谱。在第五章中我们发展了一种基于气相色谱的去垢剂定量分析方法。大多数蛋白质结构研究过程中都需要对其进行纯化,去垢剂可模拟磷脂双分子层的双亲性环境,对膜蛋白维持功能和稳定结构具有重要作用。此前一直没有快速有效的方法来对膜蛋白样品中的去垢剂进行定量分析。我们用气相色谱对去垢剂进行定量分析,并用此方法监测了膜蛋白浓缩过程中去垢剂的浓度,发现其损失的规律,找到一种简易的移除膜蛋白样品中多余去垢剂的方法。第六章中对膜蛋白结构研究的现状和核磁研究膜蛋白结构和功能的方向进行简单分析。截止到目前,被解析的膜蛋白结构仅占所有解析的蛋白质结构的1.5%左右,未来发展空间很大。因去垢剂导致的弛豫速率加快的问题,使得液体核磁共振不太适于膜蛋白结构的研究,而魔角旋转的固体核磁共振才是以后发展的方向。同时,很多膜蛋白正常功能的行使需要磷脂分子的协助,所以如何在磷脂双分子层或原位细胞膜环境中研究膜蛋白结构和功能也将是未来发展的一个很重要的方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 膜蛋白简介
• 1.1 膜蛋白功能简介
• 1.1.1 受体蛋白（receptor）
• 1.1.2 转运蛋白（transporter）
• 1.1.3 细胞粘附蛋白（Cell adhesion molecule）
• 1.1.4 酶蛋白（Enzyme）
• 1.2 膜蛋白拓扑学构型
• 1.2.1 内在膜蛋白（Integral membrane protein）
• 1.2.2 外周膜蛋白（Peripheral membrane protein）
• 1.3 膜蛋白三维结构研究
• 参考文献
• 第二章 核磁共振基本理论和方法综述
• 2.1 核磁共振研究蛋白质结构和功能简介
• 2.2 核磁共振基本理论
• 2.2.1 磁共振现象（Magnetic resonance）
• 2.2.2 化学屏蔽（Chemical shielding）
• 2.2.3 标量耦合（Scalar coupling）
• 2.2.4 偶极耦合（Dipolar coupling）
• 2.2.5 四极作用（Quadrupolar interaction）
• 2.2.6 射频场（Radio frequency interaction）
• 2.2.7 脉冲实验及傅立叶变换（FT-NMR）
• 2.3 液体核磁研究蛋白质结构和功能的实验方法
• 2.3.1 自旋回波（Spin echo）
• 2.3.2 化学位移相关谱（Correlation spectroscopy,COSY）
• 2.3.3 全相关谱（Total correlation spectroscopy,TOCSY）
• 2.3.4 交叉弛豫实验（Cross relaxation experiments）
• 2.3.5 INEPT（Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer）
• 2.3.6 Trosy（Transverse relaxation optimized spectroscopy）
• 2.4 固体核磁研究蛋白质的常用实验技术及相关理论
• 2.4.1 魔角旋转（Magic angle spinning,MAS）
• 2.4.2 重偶和去偶（Recoupling and decoupling under MAS）
• 2.4.3 交叉极化（Cross polarization,CP）
• 2.4.4 自旋扩散（Spin diffusion）
• 2.4.5 频率择性的异核交叉极化（SPECIFIC CP）
• 2.5 蛋白质特殊标记技术的应用
• 2.5.1 氘代
• 2.5.2 蛋白质片断标记
• 2.5.3 选择性氨基酸残基标记
• 13C稀释标记'>2.5.4¹³C稀释标记
• 2.5.5 甲基同位素标记
• 2.5.6 位点特异性非天然氨基酸标记
• 2.5.7 细胞外标记策略
• 参考文献
• 第三章 应用液体核磁方法解析结核杆菌“外膜”蛋白溶液结构
• 3.1 结核分枝杆菌及外膜蛋白Rv0899简介
• 3.1.1 引言
• 3.1.2 结核分枝杆菌的形态及基因特征
• 3.1.3 结核分枝杆菌的细胞膜的成分及结构
• 3.1.4 结核分枝杆菌的外膜通道蛋白
• 3.1.5 结核分枝杆菌的通道蛋白Rv0899
• 3.2 蛋白质溶液结构及动力学的核磁共振研究方法
• 3.2.1 同位素标记样品制备
• 3.2.2 化学位移归属
• 3.2.3 蛋白质结构约束信息
• 3.2.4 蛋白质动力学信息
• 3.3 实验材料与方法
• 3.3.1 生物信息学调研
• 3.3.2 分子克隆
• 3.3.3 蛋白质表达
• 3.3.4 蛋白质纯化
• 3.3.5 MTSL标记方法
• 3.3.6 超速离心分析和磷脂重组装实验
• 3.3.7 NMR、EPR和DEER实验及结构计算
• 3.3.8 ITC热滴定分析和NMR滴定结合实验
• 3.4 结果和讨论
• 3.4.1 Rv0899结构域初步分析
• 3.4.2 Rv0899三维结构计算
• 3.4.3 Rv0899作为通道蛋白的可能性
• 3.4.4 Rv0899在细胞外膜上的存在形式
• 3.4.5 Rv0899可能的生物学功能
• 3.5 总结和展望
• 参考文献
• 第四章 发展固体核磁同核交叉极化方法优化蛋白质主链归属
• 4.1 固体核磁方法研究蛋白质结构的简介
• 4.2 实验材料和方法
• 4.2.1 样品制备
• 4.2.2 核磁实验设置
• 4.2.3 数据处理
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 基本理论
• 4.3.2 基于BSH-CP的PEG-Ubiquitin二维核磁谱
• 4.3.3 用于MPD-Ubiquitin主链归属的全套三维核磁谱
• 4.4 总结及应用前景展望
• 参考文献
• 第五章 膜蛋白样品中去垢剂的定量检测及浓度控制
• 5.1 膜蛋白样品中去垢剂及检测方法简介
• 5.1.1 前言
• 5.1.2 去垢剂在膜蛋白样品制备中的作用
• 5.1.3 去垢剂定量检测方法简介
• 5.2 实验材料和方法
• 5.2.1 去垢剂分子的相变温度测定
• 5.2.2 气相色谱定量分析过程
• 5.2.3 用超滤浓缩管去除膜蛋白样品中过量的去垢剂
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 用GC定量分析去垢剂的可行性分析
• 5.3.2 用GC-FID方法检测溶液中去垢剂浓度
• 5.3.3 用GC-MS方法检测溶液中去垢剂浓度
• 5.3.4 膜蛋白样品超滤浓缩过程中去垢剂浓度变化
• 5.4 总结及展望
• 参考文献
• 第六章 核磁共振方法研究膜蛋白结构和功能展望
• 6.1 膜蛋白结构研究现状
• 6.2 核磁共振方法研究膜蛋白的展望
• 6.2.1 液体核磁共振在膜蛋白解析中的应用
• 6.2.2 固体核磁共振在膜蛋白解析中的应用
• 6.2.3 膜蛋白原位结构和功能研究
• 参考文献
• 附录
• 附录一 蛋白质表达纯化用到的培养基及缓冲液配方
• 附录二 二维NCOCA固体核磁脉冲序列
• 附录三 MPD-Ubiquitin的三维谱的详细采样参数
• 附录四 Ubiquitin微晶主链原子化学位移归属表
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果