环境胁迫对棘胸蛙（Paa spinosa）抗坏血酸及其生物合成能力的影响

论文摘要

全球两栖动物数量下降已经成为近年来倍受关注的热点问题。其原因可能是复杂多变的,如气候变暖、病菌入侵等。两栖动物作为水生到陆生的过渡类群,具有特定的生物学和生态学特征,它们对环境变化特别敏感,因此一直被作为生态环境监测的重要指示类群。抗坏血酸（Ascorbic Acid, AA）作为一种重要的多功能营养素,在动物的骨骼发育、抗应激、免疫及抗氧化等方面都起着重要的作用,而且在进化上是两栖类和爬行类抗氧化物质的典型代表。鉴于AA在生物学功能上和进化上的重要性,本课题选择AA组织水平及合成AA的关键酶—古洛糖酸内酯氧化酶（L-gulono-1,4-lactone oxidase, GLO, EC 1.1.3.8）活性作为判断两栖类机体健康状态和生存力的生物学标志（Biomarker）,研究其在胁迫状态下的反应速度和敏感性。棘胸蛙（Paa spinosa）通常栖息于亚热带或热带的高海拔山区,对环境因子如致病微生物和气候因子的变化比较敏感,抵抗环境胁迫的能力较低,可以作为环境变化的监测指示物种之一。此外在养殖条件下棘胸蛙的发病率较高,这进一步说明其对环境的敏感性。因此本课题选取棘胸蛙作为研究对象,通过人工模拟细菌入侵及暖冬状态,研究其组织AA水平及其生物合成能力的变化规律。主要结果如下：1.建立并优化了棘胸蛙GLO活性的测定方法,并将组织AA水平和GLO活力作为生境压力评价指标,研究了野生与养殖棘胸蛙的健康状态及生存力。GLO活力的测定方法主要采用二硝基苯肼比色法,从底物（古洛糖酸内酯）浓度、谷胱甘肽浓度、孵育时间及温度四个方面对酶活进行优化。结果表明：底物浓度为10mmM,谷胱甘肽浓度为0mM,在25℃下孵育60mmin是酶活最适的反应条件,酶的最大活力为（17.71±0.08）μg TAA/mg可溶蛋白/h。通过比较发现养殖棘胸蛙GLO活力较野生种群高,但其组织AA含量却低于野生个体,换言之,养殖棘胸蛙在生存环境下体内消耗的AA较多,这与他们的生存压力是一致的,说明组织AA水平和GLO活力可以作为棘胸蛙生境压力的评价指标。2.为了模拟病原体入侵导致机体的炎症反应及由此造成的氧化压力,本实验通过注射经高温灭活的大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）,于注射后1h、3h、6h、12h、24h取样测定脾巨噬细胞呼吸爆发、组织AA含量及GLO活力,研究了养殖棘胸蛙在细菌胁迫状态下各指标的动态变化规律。结果显示,注射热灭活的大肠杆菌导致脾巨噬细胞呼吸爆发强度、肾脏AA含量显著升高（P<0.05）,而GLO活力则显著降低（P<0.05）,但各项指标在24h内均能恢复至初始水平。说明注射热灭活的大肠杆菌可以刺激棘胸蛙脾巨噬细胞产生较多的氧自由基,增加机体的氧化程度。同时也证实了组织AA水平及GLO活力在一定程度上能够有效地反映棘胸蛙在细菌胁迫下的健康状况和生存力。3.不同冷暴露温度对野生和养殖棘胸蛙组织AA含量、GLO活力及能量利用的影响研究：将野生和养殖棘胸蛙同时暴露在4℃和12℃条件下,发现野生棘胸蛙在12℃冬眠条件下的死亡率较高,证明较高的冬眠温度或较高的冷暴露温度对野生棘胸蛙具有明显的致死作用,直接证明了暖冬可以干扰蛙类正常冬眠而导致其死亡。但12℃对养殖个体无致死作用,这可能是由于长期暖驯化使养殖棘胸蛙对暖冬耐受力提高。与冷暴露前相比,两个冬眠温度下野生棘胸蛙肝脏和肾脏AA含量及GLO活力均有所下降,但仅12℃冬眠组的肝脏AA含量存在统计学差异（P<0.05）。相比之下,养殖棘胸蛙无论在4℃还是12℃条件下,肝脏AA含量均有所下降（P>0.05）,但12℃条件下肾脏AA含量却先显著增加后明显下降（P<0.05）, GLO活力也受到显著抑制（P<0.05）,这体现了酶的温度依赖性。这些结果说明较高的冬眠温度使AA大量消耗,暗示冬眠温度的升高会给蛙类带来更大的氧化压力。因此组织AA水平可以反映冷暴露给蛙类带来的氧化压力,能够作为该类胁迫的生物学标记。野生棘胸蛙在4℃还表现出低温耐受性适应,如肝糖原含量增加（P<0.05）,而在12℃肌肉出现非脂肪类干物质的大量消耗（P<0.05）。养殖棘胸蛙在4℃人工冬眠条件未出现肝糖原升高的低温耐受性变化,而其对肝脏内的非脂肪干物质的消耗显著增多,说明养殖棘胸蛙对低温适应能力的下降。综上所述,棘胸蛙在细菌刺激和遭遇暖冬干扰的情况下,组织AA含量和GLO活力均出现相应的变化,反映了机体受胁迫的状态,说明组织AA含量和GLO活力能够作为生物学指标反映机体的健康状况和生存力,且棘胸蛙对于环境的变化具有足够的敏感性,可以将其作为环境变化的监测指示物种之一,根据其在环境中的受害症状,可以及时对环境作出预报。此外,本研究还可以为棘胸蛙的养殖和保护提供一定的参考依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 维生素C（Vc）生物学功能及脊椎动物Vc合成能力
• 1.1 维生素C的生物学功能
• 1.1.1 Vc的营养作用
• 1.1.2 Vc的抗应激和抗胁迫功能
• 1.1.3 Vc对免疫的影响
• 1.1.4 Vc的抗氧化和解毒功能
• 1.1.5 Vc参与能量代谢
• 1.2 脊椎动物Vc生物合成能力
• 1.2.1 脊椎动物合成Vc的能力
• 1.2.2 Vc合成部位的迁移及意义
• 1.2.3 陆生脊椎动物Vc合成的演化重要性
• 1.3 关于环境胁迫对脊椎动物Vc合成能力影响的研究
• 2 两栖类在生物监测中的应用
• 2.1 生物监测的重要性及其优势
• 2.2 以两栖动物作为指示生物的原因
• 2.2.1 两栖类的现状
• 2.2.2 两栖动物的特性
• 3 研究目的及意义
• 第二章 组织AA水平和GLO活力作为野生与养殖棘胸蛙生境压力评价指标的研究
• 1 引言
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验动物及驯化
• 2.2 化学试剂与溶液配制
• 2.3 AA的测定方法
• 2.3.1 组织样品预处理
• 2.3.2 TAA含量测定
• 2.4 GLO活力测定方法的建立和优化
• 2.4.1 样品预处理
• 2.4.2 GLO活力测定
• 2.5 组织中可溶蛋白含量的测定
• 2.5.1 蛋白标准曲线的建立
• 2.5.2 组织蛋白含量的测定
• 2.6 数据分析与统计
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 细菌刺激对棘胸蛙组织AA蓄积量及GLO活力的影响
• 1 引言
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验动物及驯化
• 2.2 大肠杆菌细胞悬液的制备
• 2.3 实验处理
• 2.4 呼吸爆发测定
• 2.5 AA组织含量及GLO活力测定
• 2.6 数据分析与统计
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四章 不同冷暴露温度对野生和养殖棘胸蛙组织AA含量、GLO活力及能量利用的影响
• 1 引言
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验动物及驯化
• 2.2 实验设计
• 2.3 化学试剂与溶液配制
• 2.4 粗脂肪含量测定
• 2.5 肝糖原测定
• 2.6 AA和GLO活力测定
• 2.7 数据分析与统计
• 3 结果
• 4 讨论
• 4.1 冬眠或长期冷暴露与AA
• 4.2 长期冷暴露或冬眠与能量代谢
• 4.3 野生与养殖棘胸蛙对不同冬眠温度的反应差异
• 小结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表的学术论文目录
• 攻读硕士学位期间参加的学术会议