兔肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素K3的还原作用

论文摘要

维甲酸（RA）是脊椎动物体内重要的生理活性物质,在细胞生长、细胞分化、形态发生、免疫功能调节等方面具有广泛的生物学作用。维甲酸在体内经由视黄醇（retinol）氧化成视黄醛（retinal）再氧化成维甲酸两步酶促反应生成,由视黄醇生成视黄醛的反应为限速步骤。辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶（NADP（H）-Dependent Retinol Dehydrogenase /Reductase NRDR）是黄东阳教授等从兔肝中发现并纯化的一种酶,具有很高的催化视黄醛（retinal）和视黄醇（retinol）之间氧化还原反应的活性,对体内类视黄醇和维甲酸（RA）的代谢平衡起着重要的调节作用。NRDR不仅对视黄醛具有较强的还原活性,还对其它很多醛酮类物质存在还原活性,所以我们认为NRDR在体内可能还担负着其他一些重要的生理功能。维生素K3（menadione）在奈醌环的1,4号位上带有两个酮基团,有着成为NRDR底物的可能。鉴于维生素K3是维生素K1（Phylloquinone）和维生素K2（Menaquinones）前体,在凝血等方面发挥着重要的作用,因此,有必要对NRDR潜在的生理功能及其对维生素K3可能的还原活性进行进一步的研究。本研究首先构建含兔NRDR全长序列的表达载体,并转化到BL21-AI菌株中进行诱导表达4 h。经超声裂解,离心后得到细菌裂解上清液,再通过金属离子亲和层析得到纯化蛋白,经过酶活性分析及SDS-PAGE分析证实得到该纯化酶蛋白为氨基端含6×His标签的兔NRDR重组蛋白。利用该纯化的重组兔NRDR酶蛋白对多种可能的底物进行活性分析,包括9,10-菲醌、维生素BB6、前列腺素E2,结果发现兔NRDR存在维生素K3（menadione）还原活性。通过化学合成、高效液相色谱分析、荧光光谱扫描等方法对维生素K3的还原产物进行鉴定,证实兔NRDR能还原维生素K3生成维生素K4（menadiol）,并在含有十二烷基磺酸钠（SDS）及去除氧气条件下,利用高效液相色谱（HPLC）对其进行酶动力学分析,测得其Km值和Vmax分别为30.70μmol和9.091μmol/（min·mg）。本研究提示参与维生素K类的代谢可能是NRDR的另一重要生理功能。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 引言
• 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.1.1 cDNA 克隆及载体构建试剂
• 1.1.2 蛋白分析试剂
• 1.1.3 酶活性分析试剂
• 1.1.4 高效液相色谱及荧光光谱扫描试剂
• 1.2 主要仪器
• 2. 方法
• 2.1 Rabbit-NRDR 重组蛋白表达载体的构建
• 2.1.1 Gateway Technology 基因克隆和蛋白表达系统介绍
• 2.1.2 重组质粒的构建
• 2.1.3 重组质粒的初步筛选
• 2.1.4 测序确认
• 2.1.5 提取重组质粒
• 2.1.6 LR 反应
• 2.2 兔NRDR在BL21-AITM细胞中的表达及性质鉴定
• 2.2.1 试剂的配制
• 2.2.2 诱导表达
• 2.2.3 蛋白浓度测定
• 2.2.4 SDS 蛋白电泳
• 2.2.5 在340nm 下监测NADPH 的消耗
• 2.2.6 重组 Rabbit-NRDR 的纯化
• 2.2.7 纯化重组蛋白的保存
• 2.3 利用反相HPLC 对Rabbit-NRDR 进行酶动力学研究
• 2.3.1 反相高压液相色谱法检测条件
• 2.3.2 流动相的配制
• 2.3.3 维生素K3的浓度梯度的建立
• 2.3.4 增溶剂 SDS 的使用
• 2.3.5 密闭反应体系的建立
• 2.3.6 表达纯化蛋白活性 Km 值的测定
• 2.4 产物的鉴定
• 结果
• 1 Rabbit-NRDR 重组蛋白表达载体的确认
• 1.1 菌落 PCR 确认入门克隆
• 1.2 测序确认 NRDR 全长序列
• 1.3 菌落PCR 确认表达克隆
• 2 Rabbit-NRDR 在BL21-AITM 细胞中的表达
• 3 Rabbit-NRDR 表达蛋白的纯化、蛋白浓度测定及活性测定
• 3.1 Rabbit-NRDR 表达蛋白的纯化
• 3.2 利用HPLC 分析Rabbit-NRDR 对维生素K3 的还原活性
• 3.3 Km 值测定
• 4 Rabbit-NRDR 对维生素K3 还原产物的鉴定
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历