猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗的研究

论文摘要

猪水疱病和猪瘟均被世界动物卫生组织（OIE）列入A类动物疫病。猪水疱病是一种急性传染病,该病的临床症状与口蹄疫及其它水疱性疾病相似,难以区分,从而妨碍了猪及猪产品的流通和国际贸易;猪瘟是一种急性烈性传染病,致病力强,危害严重。猪瘟弱毒疫苗对于控制猪瘟大流行虽然起到重要的作用,但使用弱毒疫苗后,难以区分疫苗免疫和野毒感染动物,不利于鉴别病猪。目前,国际上还没有预防猪水疱病的疫苗。研制安全高效并具有潜在标记的基因工程疫苗,将为控制猪水疱病和猪瘟探索新的技术方法。本研究通过一系列分子生物学技术制备了猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗,研究其免疫效果,为猪水疱病和猪瘟新型疫苗的研究探索一条可供参考之路。1.构建了猪水疱病结构蛋白P1区重组逆转录病毒载体（pBABE puro-P1）,并与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293包装细胞,获得了包装完整的假病毒,测定滴度。假病毒经polybrene（8μg/mL）的介导使该假病毒感染靶细胞PK-15,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。间接免疫荧光显示PK-15细胞表达的P1衣壳前体蛋白能被猪水疱病病毒（SVDV）阳性血清所识别,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性;PCR可从不同代次（分别选取第1,8,16代和30代）的阳性细胞中扩增到SVDV的P1基因,证明靶细胞可稳定的携带目的基因传代。2.大量收获阳性细胞培养物,用弗氏佐剂乳化并免疫豚鼠。通过淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA和细胞中和试验,对制备的疫苗效力进行了评价。结果显示,与对照组相比,免疫组豚鼠的外周血淋巴细胞有明显的增殖;阻断ELISA结果表明,免疫组4号豚鼠从首免后的第3周开始出现特异性SVDV抗体,而其他的免疫组豚鼠也从免疫后的第4周开始的全面出现SVDV抗体;应用微量细胞中和试验对免疫接种后第4周、第6周及第8周采集的豚鼠血清中和抗体的滴度进行了检测。结果表明,免疫接种4周时,免疫接种组2号豚鼠的中和抗体为1∶8,其余均小于1∶8;免疫接种组从第6周开始,中和抗体滴度均达到1∶8,甚至超过1∶8,而空白对照组血清中和抗体始终全部小于1∶4。3.采用与猪水疱病类似的方法建立了表达猪瘟病毒（CSFV）E2蛋白的细胞株。免疫荧光和ELISA显示,PK-15细胞表达的E2蛋白能被CSFV阳性血清所识别,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性;PCR可扩增到不同代次（本次试验分别选取第1,10,20代和30代）阳性细胞基因中的E2基因,证明靶细胞可稳定的携带目的基因传代。4.大量收获表达产物,乳化并免疫家兔。通过T淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 猪水疱病及猪水疱病病毒研究进展
• 1.1 猪水疱病研究进展
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 猪水疱病的流行病学
• 1.1.3 猪水疱病的临床症状和发病机理
• 1.1.4 诊断
• 1.1.5 猪水疱病的防控策略
• 1.2 猪水疱病病毒研究进展
• 1.2.1 猪水疱病病毒的形态及理化特性
• 1.2.2 SVDV 基因组结构
• 1.2.3 SVDV 编码的蛋白及其功能
• 1.2.3.1 结构蛋白
• 1.2.3.2 非结构蛋白
• 1.3 猪水疱病疫苗研究进展
• 1.3.1 弱毒疫苗
• 1.3.2 抗独特型抗体疫苗
• 1.3.3 基因工程疫苗
• 1.3.3.1 基因缺失毒力致弱疫苗
• 1.3.3.2 亚单位疫苗
• 1.3.3.3 基因工程活载体疫苗
• 1.3.4 合成肽疫苗
• 1.4 小结
• 第二章 猪瘟及猪瘟病毒研究进展
• 2.1 概述
• 2.2 CSFV 的病原学及生物学特性
• 2.2.1 CSFV 的病原学
• 2.2.1.1 CSFV 病毒粒子结构
• 2.2.1.2 CSFV 的理化特性
• 2.2.2 CSFV 生物学特性研究进展
• 2.2.2.1 抗原性
• 2.2.2.2 病原性及病理特性
• 2.2.2.3 遗传特性
• 2.3 CSFV 致病机制的研究
• 2.3.1 CSFV 的免疫病理学
• 2.3.2 CSFV 在体内的复制过程
• 2.3.3 猪瘟病毒对体外培养细胞的影响
• 2.4 CSFV 的分子免疫学
• 2.5 猪瘟防制策略与防制新技术的研究进展
• 2.6 结束语
• 第三章 逆转录病毒载体系统的研究
• 3.1 逆转录病毒表达系统
• 3.1.1 逆转录病毒表达载体
• 3.1.1.1 辅助病毒互补的逆转录病毒质粒载体
• 3.1.1.2 不需要辅助病毒互补的逆转录病毒载体
• 3.1.1.3 广寄主的逆转录病毒载体
• 3.1.1.4 逆转录病毒表达载体
• 3.1.2 包装细胞系
• 3.1.3 水疱性口炎病毒载体
• 3.2 逆转录病毒表达系统基本原理
• 3.3 逆转录病毒载体的构建与应用
• 3.4 影响逆转录病毒载体表达效率的影响因素
• 3.5 逆转录病毒表达系统在基因治疗及表达研究中的应用
• 3.5.1 逆转录病毒载体系统在基因治疗中的应用
• 3.5.2 逆转录病毒载体在基因表达反面的应用
• 3.6 逆转录病毒载体系统的缺陷
• 3.7 小结
• 试验研究
• 第四章 猪水疱病亚单位标记疫苗的构建及体外表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 质粒载体、工程菌及主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 细胞及种毒
• 4.1.4 引物的设计与合成
• 4.1.5 目的基因的获取
• 4.1.6 重组质粒的构建、克隆及鉴定
• 4.1.6.1 构建策略
• 4.1.6.2 重组质粒的构建即克隆方法
• 4.1.6.2.1 大肠杆菌JM109 感受态的制备
• 4.1.6.2.2 PCR 产物及载体质粒的酶切、回收及连接
• 4.1.6.2.3 连接产物的转化
• 4.1.6.2.4 重组质粒的制备
• 4.1.6.2.5 重组质粒的鉴定
• 4.1.6.3 重组SCDV HK/70 P1 基因的逆转录病毒载体的构建
• 4.1.6.4 重组质粒的测序
• 4.1.7 体外转染质粒的制备
• 4.1.8 转染包装细胞GP2-293
• 4.1.9 重组假型病毒的收获
• 4.1.10 病毒滴度的检测
• 4.1.11 假型重组逆转录病毒感染PK15 细胞
• 4.1.12 P1 基因体外表达的检测
• 4.1.12.1 P1 基因的PCR 整合鉴定
• 4.1.12.2 间接免疫荧光检测P1 基因的表达
• 4.1.12.3 P1 基因在PK15 细胞中的稳定性鉴定
• 4.2 结果
• 4.2.1 SVDV HK/70 P1 基因的PCR 扩增结果
• 4.2.2 重组质粒pBABE puro-P1 的鉴定结果
• 4.2.3 假型病毒感染PK15 细胞后PCR 鉴定P1 基因的整合结果
• 4.2.4 免疫荧光检测PK15 细胞中P1 基因的表达
• 4.2.5 P1 基因的稳定性整合鉴定结果
• 4.3 讨论
• 第五章 猪水疱病亚单位疫苗的豚鼠免疫实验
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 免疫原与实验动物
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 免疫用抗原的制备
• 5.1.4 重组抗原对豚鼠的免疫程序
• 5.1.5 T 淋巴细胞增殖实验
• 5.1.5.1 各种溶液的配制
• 5.1.5.2 淋巴细胞的分离方法
• 5.1.5.3 淋巴细胞的增殖实验
• 5.1.6 双夹心ELISA 检测免疫豚鼠的SVDV 特异性抗体
• 5.1.7 SVDV HK/70 的复壮及半数细胞感染剂量（TCID50）的测定
• 5.1.8 细胞中和实验测定豚鼠血清SVDV 抗体效价
• 5.2 结果
• 5.2.1 T 淋巴细胞增殖实验
• 5.2.2 免疫豚鼠SVDV 特异性抗体的动态变化
• 5.2.3 SVDV 半数感染剂量的测定结果
• 5.2.4 细胞中和实验测定豚鼠中和抗体
• 5.3 讨论
• 第六章 猪瘟亚单位疫苗的构建及体外表达
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 质粒载体、工程菌及主要试剂
• 6.1.2 主要仪器
• 6.1.3 细胞
• 6.1.4 引物的设计与合成
• 6.1.5 目的基因的获取
• 6.1.6 重组质粒的构建、克隆及鉴定
• 6.1.6.1 构建策略
• 6.1.6.2 重组质粒的构建及克隆的基本方法
• 6.1.6.2.1 大肠杆菌JM109 感受态的制备
• 6.1.6.2.2 PCR 产物及载体质粒的酶切、回收及连接
• 6.1.6.2.3 连接产物的转化
• 6.1.6.2.4 重组质粒的制备
• 6.1.6.2.5 重组质粒的鉴定
• 6.1.6.3 重组CSFV Shimen E2 基因的逆转录病毒载体的构建
• 6.1.6.4 重组质粒的测序
• 6.1.7 体外转染质粒的制备
• 6.1.8 转染包装细胞GP2-293
• 6.1.9 重组假型病毒的收获
• 6.1.10 病毒滴度的检测
• 6.1.11 假型重组逆转录病毒感染PK15 细胞
• 6.1.12 E2 基因体外表达的检测
• 6.1.12.1 E2 基因的PCR 整合鉴定
• 6.1.12.2 间接免疫荧光检测E2 基因的表达
• 6.1.12.3 夹心 ELISA 检测 E2 蛋白的活性
• 6.1.12.4 E2 基因在PK15 细胞中的稳定性整合鉴定
• 6.2 结果
• 6.2.1 CSFV Shimen E2 基因的PCR 扩增结果
• 6.2.2 重组质粒pBABE puro-E2 的鉴定结果
• 6.2.3 假型病毒感染PK15 细胞后PCR 鉴定E2 基因的整合结果
• 6.2.4 E2 基因的稳定性整合鉴定结果
• 6.2.5 免疫荧光检测PK15 细胞中E2 基因的表达
• 6.2.6 ELISA 检测细胞培养物中E2 蛋白的生物学活性
• 6.3 讨论
• 第七章 猪瘟亚单位疫苗的兔免疫保护实验
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 主要试剂
• 7.1.2 免疫用的抗原的制备
• 7.1.3 重组抗原对家兔的免疫实验
• 7.1.4 T 淋巴细胞增殖实验
• 7.1.4.1 各种溶液的配制
• 7.1.4.2 淋巴细胞的分离方法
• 7.1.4.3 T 淋巴细胞增殖实验
• 7.1.5 阻断ELISA 检测免疫家兔的CSFV 特异性抗体
• 7.1.6 实验兔子的病毒攻击保护实验
• 7.2 结果
• 7.2.1 T 淋巴细胞增殖情况
• 7.2.2 免疫兔子CSFV 特异性抗体的动态变化
• 7.2.3 攻毒兔子的免疫保护实验结果
• 7.2.3.1 兔子体温变化
• 7.2.3.2 攻毒兔子脾脏变化
• 7.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介