泛素结合酶基因UbcH10调控脑胶质瘤细胞恶性生物学行为的实验研究

论文摘要

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一,约占全部脑肿瘤的45～55%。目前,脑胶质瘤的治疗手段主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗和综合治疗等,尽管近年来上述治疗措施已取得长足进步,但由于胶质瘤呈浸润性生长,与周围脑组织无明显分界且易于复发,且疗效均不甚理想。新的治疗手段如基因治疗等虽有望成为治愈胶质瘤的途径之一,但是目前仍缺乏理想可靠的治疗靶标。因此寻找调控胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子靶标,明确其在胶质瘤发病过程中的病理机制,已成为神经外科领域的研究热点之一。泛素/蛋白酶体介导的蛋白质降解途径（Ubiquitin-proteasome proteolytic pathway,UPP途径）是蛋白质转录后降解的重要方式之一,此途径主要由泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）和26S蛋白酶体组成。目标底物蛋白通过上述酶的序贯作用后与泛素发生共价结合,继而被26S蛋白酶体识别并降解。UPP途径参与细胞周期进程、DNA转录/修复、细胞增殖分化和凋亡等诸多生物学过程,该途径的异常与肿瘤的发生发展关系密切。我科前期基因芯片以及ONCOMINE生物芯片研究结果证实,E2蛋白酶家族成员之一—泛素结合酶UbcH10在脑胶质瘤组织中表达异常上调,并在多种周围肿瘤组织中出现过度表达。作为在多种来源肿瘤组织中异常表达的“枢纽基因（hub gene）”,UbcH10过度表达可能与肿瘤发生发展过程密切相关。因此,探讨UbcH10参与脑胶质瘤发生发展以及恶变的分子病理机制,有助于明确胶质瘤的恶性生物学行为及机理,有望为胶质瘤的临床治疗提供新的分子靶标。本研究拟通过观察UbcH10在不同病理级别脑胶质瘤以及胶质瘤细胞株中的确切表达情况,并通过敲减UbcH10在胶质瘤细胞株中的表达,研究UbcH10在胶质瘤发生发展过程中的功能角色。实验共分为三个部分:第一部分,观察UbcH10在脑胶质瘤组织中的mRNA和蛋白表达水平以及与胶质瘤病理级别的相关性;第二部分,观察UbcH10在U251和SHG-44脑胶质瘤细胞株中的mRNA和蛋白表达水平及其与胶质瘤细胞细胞周期的关系;第三部分,通过RNA干扰的方法敲减UbcH10的表达观察其对U251胶质瘤细胞株增殖、凋亡等细胞表型的影响。第一部分泛素结合酶基因UbcH10在脑胶质瘤组织中的表达研究目的:研究UbcH10在脑胶质瘤组织中的mRNA剪切形式、mRNA和蛋白表达水平及其与胶质瘤病理级别的相关性。方法:根据UbcH10的cDNA序列设计相应引物,应用RT-PCR和直接测序的方法检测UbcH10 mRNA的不同剪切形式在32例不同级别脑星形胶质细胞瘤和6例正常脑组织中的表达。应用实时荧光定量PCR检测UbcH10 mRNA在上述组织标本中的相对表达水平,应用免疫组织化学染色检测UbcH10在55例脑星形胶质细胞瘤组织和7例正常脑组织中的蛋白表达水平,并检测UbcH10蛋白与增殖抗原Ki-67表达的相关性,最后应用免疫荧光双重染色技术获取UbcH10蛋白的细胞定位信息。结果:32例脑星形胶质细胞瘤和6例正常脑组织mRNA反转录后进行PCR扩增获得450bp左右产物,经直接测序证实与UbcH10 splice vl序列一致（GenBankaccession nos.NM007019）。实时荧光定量PCR结果提示UbcH10 mRNA表达水平在星形胶质瘤组织中明显上调,与正常脑组织相比差别显著（44.33±55.32 vs 1.00±1.57;P=0.000）。并且,UbcH10 mRNA水平在高级别胶质瘤组织中的表达水平明显高于低级别胶质瘤,二者相比差异显著（64.33±60.98 vs 8.36±8.15;p=0.000）。相似地,免疫组织化学染色提示UbcH10蛋白在星形胶质细胞瘤组织中表达明显上调,与正常脑组织相比差别显著（7.90±5.70%vs 0.0±0.0%;P=0.000）,且高、低级别胶质瘤之间差别显著（10.53±5.79%vs 4.23±2.85%;P=0.000）,UbcH10阳性细胞染色率与增殖抗原Ki-67蛋白表达呈明显的正相关关系（Spearman r=0.63,P＜0.001）。双重免疫荧光染色提示UbcH10蛋白与GFAP蛋白共定位于胶质瘤细胞胞浆。结论:UbcH10以splice vl mRNA剪切形式表达于所有被检测的星形胶质细胞瘤和正常脑组织中,但其在星形胶质细胞瘤组织中的mRNA和蛋白表达水平明显高于正常脑组织,并和胶质瘤病理级别以及增殖抗原Ki-67表达呈正相关性,提示UbcH10可能在星形胶质瘤的发生发展恶变过程中具有重要作用。第二部分UbcH10在U251,SHG-44胶质瘤细胞株中的表达及其与细胞周期的关系目的:研究泛素结合酶UbcH10在胶质瘤细胞系U251和SHG-44中的mRNA、蛋白表达水平和细胞亚定位水平;研究UbcH10蛋白在不同细胞周期的表达及与细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B1的关系。方法:应用RT-PCR、实时荧光定量PCR等方法检测UbcH10在胶质瘤细胞系U251和SHG-44中的mRNA剪切形式和表达水平,应用细胞免疫组化、蛋白印迹等方法研究UbcH10在胶质瘤细胞系中的蛋白表达水平,应用免疫荧光染色检测UbcH10在胶质瘤细胞中的细胞亚定位水平及其与Ki67蛋白的定位关系。采用无血清饥饿、胸腺嘧啶阻断和Nocodazole等方法分别同步化细胞于G0、G1/S和G2/M期,应用蛋白印迹实验检测UbcH10在上述不同细胞周期的表达情况及其与细胞周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin B1的相互关系。结果:经过PCR扩增和直接测序发现UbcH10在胶质瘤细胞系中的mRNA剪切形式为splice vl（GenBank accession nos.NM007019）。荧光定量RT-PCR结果提示UbcH10 mRNA表达水平在胶质瘤细胞系U251和SHG-44中明显上调,与正常脑组织相比差别显著（33.77±21.54,30.20±20.13 vs 1.00±1.57;P=0.000）。免疫组织化学染色和免疫荧光染色提示UbcH10蛋白主要表达于胶质瘤细胞胞浆,并且部分表达UbcH10细胞亦表达增殖抗原Ki67,蛋白印迹实验证实其在U251和SHG-44细胞系中的表达水平明显高于正常脑组织（0.40±0.23 vs 0.0±0.0;P＜0.05）。UbcH10主要表达于G2/M期,在G0,G1/S期表达甚少。自双胸腺嘧啶阻断释放后,UbcH10的表达逐渐升高,在G2/M期达到高峰,并与细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B1呈消长关系;自Nocodazole阻断释放后,UbcH10表达逐渐下降,细胞周期蛋白Cyclin A、Cyelin B1表达亦逐渐下降。结论:UbcH10以splice vl mRNA剪切形式表达于所有被检测的星形胶质瘤细胞系中,其mRNA和蛋白表达水平明显高于正常脑组织,UbcH10在胶质瘤细胞系中的表达与细胞周期密切相关,在G2/M期达到峰值。第三部分靶向UbcH10的RNA干扰对U251胶质瘤细胞株增殖、凋亡和细胞周期改变的作用目的:研究靶向UbcH10的RNA干扰对U251胶质瘤细胞株增殖、凋亡的作用。方法:设计并合成靶向UbcH10的siRNA,脂质体法瞬时转染U251细胞株,优化转染条件。MTT法测定转染后24、48、72和96小时U251细胞增殖率,Annexin/PI双染测定干扰后24、48和72小时早期凋亡细胞比例和细胞周期改变,TUNEL原位检测UbcH10 siRNA 48h后凋亡细胞比例,蛋白印迹实验测定转染后48小时Cyclin A、Cyclin B1、PCNA、Bax、Bcl-2、P53等蛋白表达水平变化。结果:UbcH10 siRNA可有效敲减U251细胞UbcH10的表达。MTT法检测UbcH10siRNA转染组24,48,72和96小时的细胞生长吸光值分别为0.060±0.009,0.082±0.010,0.139±0.028,0.235±0.045;较阴性对照组（0.115±0.026,0.217±0.038,0.381±0.040,0.646±0.077）和未转染组（0.101±0.017,0.215±0.048,0.390±0.047,0.747±0.126）降低;其中24、48、72和96小时细胞生长与对照组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。经流式细胞仪检测,24,48,72小时靶向siRNA转染引起U251胶质瘤细胞的凋亡率分别为22.70±8.83%,12.37±2.14%和5.97±1.20%,阴性对照组为8.00±1.67%,4.63±1.45%和5.77±1.34%,未转染组为4.07±1.06%,4.60±1.01%和4.27±0.90%。在24、48小时,早期凋亡比例均高于对照组和未转染组,两者之间差异显著（P＜0.05）。靶向UbcH10 siRNA转染U251细胞48小时后G2/M期细胞比例显著升高,较阴性对照组和未转染组差异显著（37.53±2.04%vs 18.01±1.60%,18.62±0.69%;P＜0.05）。TUNEL检测结果显示,在UbcH10 siRNA转染组中,有散在分布的阳性染色细胞,其比例明显高于阴性对照组和未转染组（26.75±7.56%vs 7.64±3.75%,4.33±2.10%,P＜0.05）。敲减UbcH10的表达后,Cyclin A的表达在干扰后出现升高,与对照组相比差异显著;Cyclin B1的表达在干扰后亦出现升高趋势;PCNA的表达在干扰后即下降,并且持续至干扰后72小时,与对照组相比差异显著;Bax的表达在干扰后出现升高,Bcl-2的表达在干扰后24至48小时出现降低,与对照组相比差异显著;P53的表达在干扰后出现升高,与对照组相比差异显著,p-P53的表达在干扰后亦出现升高趋势,48和72小时与对照组相比差异显著。然而,Akt、p-Akt、P38、p-P38、c-Jun和p-c-Jun等蛋白表达水平无明显改变。结论:通过RNA干扰敲减UbeH10在U251胶质瘤细胞中的表达可有效抑制肿瘤细胞的增殖,其可能原因是通过减少cyclin A和cyclin B1的降解,由此导致细胞周期的阻滞;敲减UbcH10表达可促进P53、Bax蛋白的表达,并抑制Bcl-2的表达,由此促进胶质瘤细胞P53途径依赖的凋亡;敲减UbcH10对MAPKs、P13K/Akt和c-Jun介导的信号转导通路重要调控分子活性无明显影响。由此可见,敲减UbcH10的表达可以抑制胶质瘤细胞的增殖并且促进其凋亡,抑制UbcH10表达可能作为未来胶质瘤靶向治疗的选择之一。

论文目录

• 中英文缩略词对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 泛素结合酶基因UbcH10在脑胶质瘤组织中的表达研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 泛素结合酶基因UbcH10在胶质瘤细胞系中的表达研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 靶向UbcH10的RNA干扰对胶质瘤细胞增殖、凋亡的作用
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 致谢
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
• 附件