论文摘要
铅是一种常见的重金属,由于其延展性好、抗腐蚀能力强、熔点低等特性,在工业生产和日常生活中被广泛应用。铅无法被生物所降解,所以其在环境各相和生物系统中持续存在,造成了全球性的空气、水、土壤铅污染的问题,并对人类健康构成持续性的威胁。铅暴露能引起人体的生理、生化及行为等方面发生异常。大量的研究已证实铅毒性可涉及到人体全身,累及神经、血液、心血管、泌尿、生殖、骨骼、内分泌及免疫等系统;其中神经毒性由于对学龄前儿童的严重危害而受到更为广泛的关注。近些年来,铅的毒性机理也得到了较为充分的研究,发现铅主要通过与蛋白结合和模拟钙的功能产生毒性。最近许多研究还发现铅能引起大鼠脑、睾丸、成纤维、肺和视网膜细胞发生凋亡,提示细胞凋亡可能在铅毒性中起了重要的作用。细胞凋亡是一种高度受调控的细胞死亡方式,是应对外界刺激,维持机体平衡的重要手段。细胞凋亡的调控十分复杂,主要有三条信号途径参与其中:死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。凋亡的信号途径涉及了数百个基因和蛋白,从而构成了一个复杂的网络系统,对细胞的生或死进行精密的调控。以往的研究中提示,线粒体途径可能在铅诱导细胞凋亡中起了主要作用。然而,铅是如何导致线粒体功能失调以及哪些上游信号参与了线粒体途径尚未明确。此外,铅能扰乱内质网钙的稳态,而内质网途径是否也参与了铅诱导细胞凋亡的过程尚无研究报道。综上所述,本研究以神经元模式细胞—PC 12细胞为研究对象,验证乙酸铅能否诱导PC 12细胞发生凋亡。在此基础上,根据已知的模式生物细胞凋亡机理逐步推测线粒体上游途径的参与者（如DNA损伤、p53蛋白、Bcl-2家族蛋白、细胞色素c和caspase-3等）,并用相关实验进行验证,最终勾画出较为完整的铅诱导细胞凋亡的线粒体途径。此外,通过检测内质网凋亡事件（如内质网特异性的凋亡酶caspase-12和钙蛋白酶calpain是否被激活;GRP78和CHOP表达是否发生改变等）,进一步探索内质网途径在此过程中的作用,以期对铅诱导凋亡的机理有更为全面的认识。主要实验结果:1.乙酸铅能引起PC 12细胞增殖显著下降。2.光镜下观察,乙酸铅对PC 12细胞的形态和细胞骨架无明显改变。3.电镜下观察,乙酸铅能使细胞核固缩,线粒体肿胀、正常结构消失并伴有空泡化,胞内出现鼓泡现象,但内质网未见异常。4.乙酸铅能引起PC 12细胞DNA链断裂,损伤程度存在浓度依赖关系。5.乙酸铅能诱导PC 12细胞发生凋亡,并存在浓度依赖关系。6.乙酸铅能引起caspase-3活化程度显著增强,并存在浓度依赖关系。7.乙酸铅对PC 12细胞的calpain活性无明显改变。8.乙酸铅能促进PC 12细胞胞质细胞色素c水平的提高,Bax和p53表达增加,Bcl-2表达下降,Bax/Bcl-2比值上升。9.乙酸铅能促进PC 12细胞GRP78表达的增加,而CHOP和procaspase-12表达未改变,caspase-12未剪切活化。结论:1.铅诱导细胞凋亡的线粒体途径:铅通过损伤细胞DNA诱导p53激活,并进一步引起Bax表达增加,导致Bax/Bcl-2比值升高,线粒体通透性改变,细胞色素c等促凋亡物质释放入胞质,引起caspase级联激活,并最终导致细胞凋亡的发生。2.结合形态学和生化研究结果,在本研究条件下,铅通过线粒体途径诱导细胞凋亡,而内质网途径可能并未参与此过程。3.铅诱导细胞凋亡生化指标改变的同时,细胞器也发生了形态学改变。4.细胞凋亡可能在铅致毒过程中起了重要的作用。
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