论文摘要
21世纪是系统生物学的世纪,基因转录组学和蛋白质组学是系统生物学研究的重要基础。水稻（Oryza sativa）是模式单子叶植物,基因组测序已经完成,基因转录组学和蛋白质组学分析成为解析水稻生物学问题的新途径,在许多研究领域已经广泛开展。水稻条纹叶枯病是一种重要的水稻病毒病,由水稻条纹病毒（Ricestrip virus,RSV）所致,近年来在我国稻区连年暴发,防治起来十分困难。虽然RSV的流行学、分子生物学和分子变异等研究已比较深入,但有关病害的发生机制尚知之甚少。本研究采用基因芯片技术和IPG-SDS-PAGE蛋白质双向电泳结合质谱鉴定技术,从转录和翻译水平上分析了具有相近遗传背景但抗性程度明显不同的两个水稻品种武育粳3号和KT95-418在感染RSV后的基因表达谱变化,为揭示水稻条纹叶枯病的发生机制,从根本上防治病害的发生奠定实验基础。通过与Affymetrix水稻全基因组芯片杂交,分别获得了武育粳3号和KT95-418在接种RSV后出现条纹症状第7天的水稻植株地上部分（处理组）及未接种水稻在相应生育期和相应部位的健康组织（对照组）的基因表达谱,每个实验处理重复三次,每次重复分别取自单棵的水稻植株。以SAM软件分析中FDR接近5%和表达变化倍数大于2的基因为差异基因,分别比较了两个水稻品种处理组与其对照组的基因表达谱差异,共获得了1931个差异基因。其中,在武育粳3号处理组与对照组的比较中共得到了1666个差异基因,包括819个在处理组中相对对照组中表达上调的基因和847个表达下调的基因;在KT95-418处理组与对照组的比较中共得到了561个差异基因,其中153个基因在处理组中相对对照组中表达上调,408个表达下调;两组差异基因之间共有296个是共同的,包括95个在两个水稻品种的处理组中相对其对照组中都上调表达的基因和201个都下调表达的基因。以在本研究中12张芯片上都被检测为“表达”的18152个探针组为背景,沿用DAVID系统的经验阈值（至少包括两个基因且P值＜=0.1）,对各组差异基因进行了功能注释聚类,判断显著性富集的注释类别。结果显示:1.在两个水稻品种感染RSV后,许多叶绿体相关、核糖体相关和电子转运相关的功能基因被共同诱导表达;2.结合金属离子的氧化还原酶类和非生物胁迫相关基因在两个水稻品种中被共同抑制表达;3.一些叶绿体相关的蛋白质复合体、热激蛋白、光合作用、DNA依赖的RNA聚合酶、定位于质体中的细胞代谢相关基因及核糖核蛋白和无机阳离子转运载体基因仅在感染RSV后的武育粳3号中被诱导表达;4.仅在感染RSV后的武育粳3号中被抑制表达的646个基因,涉及的功能注释复杂,8个聚集类别的可信度达到了显著性水平;这些聚类在一起的注释主要归为5类:光合作用相关,信号传导,蛋白质合成、定位与修饰,代谢酶类和转录因子;其中富集度最高的是质体相关基因和类囊体上的光系统Ⅱ反应中心;具有离子结合活性、信号传导相关、蛋白酶抑制子、蛋白质合成相关的核糖体蛋白及DNA指导的RNA聚合酶等基因注释关键词在其中频繁出现;5.仅在感染RSV后的KT95-418中被诱导表达的基因有58个,抑制表达的基因207个,由于注释信息的不完善,功能注释聚类未能得到它们的显著性富集类别。为了明确这些差异基因之间的关系,我们通过合并KEGG（release 45.0）和RiceCyc（version 1.3）两个代谢途径数据库的注释信息,分别对各组差异基因进行了代谢途径分析。结果显示:1.细胞分裂素生物合成途径在感染RSV后的武育粳3号中变化明显,13个相关的差异表达基因中,10个上调,3个下调;2.光合作用是寄主在感染RSV后发生病理学变化的重要位点,相关基因在两个水稻品种中的表达趋势复杂,既有下调又有上调;3.脂肪的代谢在两个水稻品种中都被调节,但二者所调节的基因有所不同;4.3个表皮蜡质生物合成相关的基因、2个茉莉酸生物合成相关的基因在武育粳3号中特异性表达上调;5.一些与细胞周期的调节相关的基因在武育粳3号中特异性表达下调;6.参与类黄酮合成途径的不同基因在两个水稻品种中表达下调;7.氨基酸的代谢比较复杂:缬氨酸的生物合成和精氨酸/脯氨酸的代谢相关基因在两个水稻品种感染RSV后表达都被抑制,酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、苏氨酸的生物合成相关基因在武育粳3号中被诱导表达,丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸生物代谢相关的一些基因仅在武育粳3号中被抑制表达;8.在两个水稻品种中共同抑制表达的基因中,功能注释主要有:氨基酸（丙氨酸）生物合成、蔗糖降解、脂类代谢、细胞节律、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）补偿途径及磷酸戊糖途径、半乳糖代谢、谷胱甘肽解毒、甲基乙二醛降解和海藻糖生物合成等。采用ImageMaster软件分别比较两个水稻品种处理组和对照组的蛋白质双向电泳图谱,结果显示在两个水稻品种的处理组图谱上分子量20 kDa～25kDa,等电点4.5～5.5的位置有大量的RSV SP蛋白积累。在分子量小于30kDa的凝胶区域中,本研究另外选取了44个差异表达的蛋白质点进行后续分析。其中在武育粳3号处理组与对照组的比较中选取了33个差异表达的蛋白质点,包括25个在RSV处理后信号减弱的蛋白质点和8个在RSV处理后新增的蛋白质点;在KT95-418处理组与对照组的比较中选取了15个差异表达的蛋白质点,包括7个在处理组中表达减弱,5个在处理组样品的凝胶图谱上消失,3个在RSV诱导后出现的蛋白质点。两组差异蛋白质点中,有4个蛋白质点是共同的,它们在两个水稻品种处理组中的表达量相对对照组都有所减少,且在武育粳3号中的减少程度比KT95-418中更多。经MALDI-TOF-TOF/MS串联质谱分析和Mascot软件检索NCBInr数据库,25个蛋白质点得到鉴定。它们分别是22个基因编码的产物,16个来源于水稻,1个来源于RSV,5个来源于其它植物。鉴定成功的蛋白质包括:水稻Rubisco与2-羧阿拉伯糖醇-1,5-二磷酸（2-carboxyarabinitol-1,5-bisphosphate,2-CABP）形成的结晶结构中与小亚基同源的肽段,3个分别来自丫蕊花（Ypsilandra thibetica）、本亭琪亚棕（Bentinckia nicobarica）和短毛狸藻（Utricularia pubescens）的Rubisco大亚基同源肽段,质体蓝素,类囊体内腔P17.4,细胞色素b6-f复合体Fe-S亚基,光系统Ⅱ放氧复合体蛋白23kDa多肽前体,定位于叶绿体的Cu-Zn超氧化物岐化酶前体和TRX-M前体,Cu-Zn超氧化物岐化酶,Os02g0328300（与一种具有氧化还原酶活性的果实蛋白具有较高的同源性）,Os02g0192700（硫氧还蛋白过氧化物酶）,Os08g0116500（60S酸性核糖体蛋白质）,核糖体蛋白质L12,ADPG焦磷酸化酶,核糖-5-磷酸异构酶,甘氨酸剪切系统蛋白H,小泛素相关修饰物（smallubiquitin-like modifier,SUMO）,RSV NS2蛋白及2个功能未知的蛋白质Os06g0705100和Os10g0330000。综合基因转录谱和蛋白质表达谱分析,本研究认为光合作用、细胞的氧化还原平衡及离子平衡、蛋白质的翻译及加工和转运、三大类物质的代谢等途径在感染RSV后的水稻中受到明显干扰。本文对这些代谢途径在病毒与寄主互作中的重要地位和它们与病害症状形成的关系进行了讨论,并为探索水稻条纹叶枯病的系统病理学研究提供了大量的实验数据。