用多维核磁共振技术研究人去甲基化酶JARID1B-ARID的溶液结构及其与DNA的相互作用

论文摘要

随着计算机技术,电子技术,高场磁体及脉冲程序的发展,核磁共振技术已经在有机化学、生物化学、物理化学、无机化学及医学等研究领域中得到了广泛的应用,尤其在生物大分子和有机化合物结构的鉴定及分子动力学方面,成为极其重要的研究手段。在获得原子水平的物质结构方面,其精密度及准确度等方面,核磁共振技术可以和与X-ray单晶衍射方法相媲美,其应用广泛性和简便性方面更有X-ray单晶衍射方法无法比拟的优势。JARID1B/PLU-1,属于JARID1家族,是一个包含1544氨基酸的多结构域的核蛋白。它以H3K4模式执行组蛋白去甲基化功能,属于JmjC去甲基化酶家族的一员,同时又是一个强转录抑制子,被发现在乳腺癌细胞中调节基因表达活性。它包含一个ARID/BRIGHT DNA结合绑定结构域（110个氨基酸）,它通过这个结构域与DNA的结合从而调控对组蛋白的去甲基化功能。本论文主要以核磁共振为主要技术手段,辅助其他一些生化及分子生物学技术手段,研究了人去甲基化酶JARID1B-ARID结构域的溶液结构及其与DNA相互作用的机制,取得了一些有意义的研究结果。本论文主要由以下四部分组成：第一章：综述了核磁共振技术与应用的进展。第二章：对人去甲基化酶JARID1B-ARID结构域进行了克隆,表达,纯化和NMR归属。通过CSI方法计算出人JARID1B-ARID包含6个a螺旋,这一结果与其他ARID蛋白一致。第三章：应用核磁共振技术和其它生化技术对人JARID1B-ARID与DNA的相互作用进行了验证,并通过突变实验进一步验证了结果。化学位移扰动结果证实柔性的loopl区域为蛋白与DNA的主要结合位点。EMSA和内源荧光证实,突变loopl上的关键氨基酸会显著影响其与DNA的结合。此外,通过免疫荧光证实全长的JARID1B突变体会影响去甲基化酶的活性。第四章：运用NMR方法对人JARID1B-ARID的主链动力学行为进行了分析和描述。我们认为人JARID1B-ARID大体上是一个比较刚性的结构,在loop区域存在明显的柔性和构像化学交换,与Mrf2-ARID的主链动力学行为进行比较,我们认为JARID1B-ARID的loop区的柔性可能是影响其与DNA结合特性的因素。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 生物核磁共振技术简介
• 第一节 用核磁共振技术研究蛋白质结构
• 1. 生物NMR样品的制备
• 2. 生物大分子的三维结构测定
• 第二节 用NMR方法研究生物大分子的相互作用
• 第三节 用NMR方法研究生物大分子的动力学
• 参考文献
• 第二章 用核磁共振技术研究人JARID1B-ARID蛋白的溶液结构
• 第一节 人去甲基化酶JARID1B的ARID结构域的背景介绍
• 1. 去甲基化酶JmjC超家族的背景介绍
• 2. DNA-binding结构域ARID超家族的背景介绍
• 第二节 材料和方法
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 第三节 结果和讨论
• 1. 人JARID1B-ARID蛋白的克隆,表达与纯化
• 2. 人JARID1B-ARID蛋白的分子层析和质谱鉴定
• 3. 人JARID1B-ARID蛋白的共振信号指认
• 4. 人JARID1B-ARID蛋白的二级结构预测
• 5. 人JARID1B-ARID的结构描述及其与同源蛋白的比较分析
• 参考文献
• 第三章 用核磁共振及其它生化技术研究JARID1B-ARID与DNA的相互作用
• 第一节 引言
• 第二节 实验材料和方法
• 第三节 结果与讨论
• 1. 用化学位移扰动法测定人JARID1B-ARID与DNA的结合位点
• 2. 用EMSA方法测定人JARID1B-ARID及其突变体与DNA的结合
• 3. 用内源荧光光谱法测量DNA与人JARID1B-ARID及其突变体的结合常数
• 4. 用细胞免疫荧光方法验证全长JARID1B蛋白与突变体的去甲基化酶的活性
• 参考文献
• 第四章 用核磁共振技术研究人JARID1B-ARID蛋白的主链动力学
• 第一节 引言
• 第二节 实验材料和方法
• 第三节 结果与讨论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 后记