论文摘要
中国水仙是石蒜科水仙属多年生的单子叶草本植物,因花的观赏价值和经济价值,成为深受人们喜欢的传统名花之一。本试验研究以中国水仙的带盘鳞茎为试验材料诱导小鳞茎,建立中国水仙高效的离体再生体系；根据已知的ZDS基因序列,构建了ZDS反义基因植物表达载体；采用根癌农杆菌介导的方法将ZDS反义基因转化中国水仙。其主要结果如下：1中国水仙稳定高效的再生体系的建立 以中国水仙三年生鳞茎为材料,结果表明鳞茎采用55℃水处理5min+0.1%升汞12 min消毒方式的效果好；以6-BA、NAA和2,4-D为因素对小鳞茎诱导进行正交设计试验,结果为最佳的小鳞茎诱导培养基是改良MS培养基+2.0mg/L6-BA+0.0 mg/L 2,4-D+0.6 mg/L NAA,诱导率达到214.10%。并以6-BA、NAA和白糖浓度为因素对小鳞茎受体系统影响的正交设计,结果表明在改良MS培养基+2.0 mg/L6-BA +1.0 mg/L NAA+30 g/L白糖培养基上,小鳞茎的诱导率达到88.89%；小鳞茎的最佳壮苗生根培养基为1/2MS+0.2 mg/L NAA,生根率达到87.00%；以泥炭土、珍珠岩和土的混合基质为移栽基质,移栽成活率达到95.00%。2中国水仙ZDS反义基因载体的构建 以中国水仙花瓣与副冠为材料提取总RNA,反转录合成cDNA第一链。根据已克隆得到的中国水仙ZDS基因序列和pCAMBIA1301双GUS载体上的酶切位点设计1对含有XbaI和SacI限制性酶切位点的特异性引物,通过RT-PCR得到中国水仙ZDS基因,并回收目的片段,将得到的目的片段与PMD18-T载体的连接,转化,得到重组质粒,然后与pCAMBIA1301双GUS载体进行双酶切反应,将回收产物进行定向的连接,将克隆片段反向补插入到pCAMBIA1301双GUS植物表达载体上,得到重组质粒P1301-ZDS,然后将重组质粒导入根癌农杆菌中,并进行PCR检测,结果显示成功构建植物反义载体。3根癌农杆菌介导中国水仙小鳞茎转化体系的确立试验表明侵染前经过6d的预培养、用MS液体培养基作为根癌农杆菌重悬液、根癌农杆菌重悬液的浓度OD600为0.6、根癌农杆菌重悬液中的白糖浓度为60 g/L、30min作为根癌农杆菌侵染小鳞茎的时间、在25℃黑暗条件下、PH值为5.8培养基中共培养7d。用上述方法进行稳定的转化试验。4抗性小鳞茎的筛选及再生植株的检测 试验表明采用延迟筛选法对抗性小鳞茎筛选效果是最好的,通过延迟筛选法共获得12株潮霉素抗性植株。对12株中国水仙转基因再生植株的叶片进行了GUS组织化学检测,发现12株中国水仙转基因植株有10株是稳定表达GUS基因的。并经过对转基因再生植株潮霉素标记基因的PCR检测结果显示,11株转基因再生植株有检测到潮霉素基因。这些表明11株转基因植株中外源潮霉素基因已稳定整合到中国水仙基因组中。把转化植株与未转化植株对比,表型上并无差别。（将12株转基因植株移栽至大田,均成活。）总而言之,本试验建立了高效的中国水仙再生体系,成功构建了反义基因植株表达载体,优化了根癌农杆菌介导转化中国水仙小鳞茎的转化条件,首次将ZDS反义基因转入了中国水仙小鳞茎中,探索出了筛选中国水仙抗性小鳞茎的方法并成功获得了转基因植株,为中国水仙的遗传转化提供了参考依据和技术平台。