论文摘要
目的G蛋白偶联受体40（GPR40）是表达于β细胞的特异性游离脂肪酸（FFA）受体,介导FFA对β细胞胰岛素分泌功能的调节。本研究观察不同浓度的葡萄糖和棕榈酸（PA）作用不同时间对胰岛素分泌功能和胰岛素、GPR40基因表达的影响;观察不同浓度的葡萄糖和PA对细胞活性和细胞凋亡的影响;抑制或增强GPR40的表达,观察PA对β细胞胰岛素分泌功能、胰岛素基因表达和细胞活性、凋亡的影响,探讨GPR40在β细胞功能及脂性凋亡中的作用;并通过对活性氧和胰岛素信号途径胰岛素受体底物（IRS）和蛋白激酶B（PKB）磷酸化的检测进一步研究脂毒性诱导β细胞功能障碍及脂性凋亡的分子机制。方法利用siRNA和质粒转染技术,抑制或增强GPR40的表达,在不同糖浓度下用PA培养24-48h,RT-PCR方法检测胰岛素和GPR40基因的表达,放射免疫法检测胰岛素分泌的变化,流式细胞术和免疫荧光方法检测细胞凋亡的变化,酶标法测定活性氧的表达,western blot检测IRS、PKB磷酸化水平的变化。结果一、不同浓度葡萄糖及PA对INS-1细胞胰岛素分泌的影响:以5.6 mmol/L葡萄糖（5.6mG）细胞培养24h作为基础对照组,与基础对照组相比,5.6mG培养48h对基础状态胰岛素分泌和葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）均无明显影响,而16.7 mmol/L葡萄糖（16.7mG）、33.3 mmol/L葡萄糖（33.3mG）培养24小时后,基础状态下胰岛素分泌没有显著变化,但GSIS显著下降,分别较5.6mG对照组下降23.9%、28.5% （P<0.01）。16.7mG、33.3mG培养48小时后,基础状态下胰岛素分泌分别较对照组下降10%（P>0.05）和11%（P>0.05）,差异无显著统计学意义,但GSIS下降更明显,分别比对照组降低30%和34%（P<0.01）。在5.6mG和33.3mG浓度条件下加入PA孵育48h作为慢性刺激,与5.6mG基础对照组相比,GSIS在5.6mG+PA、33.3mG+PA组分别减少了13%（P>0.05）和44%（P<0.01）;与相应的33.3mG无PA组相比,33.3mG+PA组GSIS下降20%（P<0.05）。这说明在高糖条件下,高浓度游离脂肪酸对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的抑制作用更加显著。二、不同浓度的葡萄糖、PA对胰岛素mRNA表达的影响:葡萄糖对INS-1细胞胰岛素表达的影响与葡萄糖浓度和作用时间有关。以5.6 mG培养24h作为基础对照组,与基础对照组相比,5.6mG培养48h胰岛素mRNA的表达变化无显著性。随着葡萄糖浓度的进一步升高,胰岛素mRNA的表达量逐渐下降。与对照组相比,16.7mG和33. 3mG培养24小时,胰岛素mRNA表达分别下降22.3%和30.5% （ P<0.01）;培养48小时后,16.7mG和33.3mG培养组胰岛素mRNA表达进一步降低,较5.6mG对照组分别下降36%与50% （P<0.01）。5.6mG条件下加入PA培养48h,胰岛素mRNA表达无明显变化;在33.3mG条件下加入PA培养48h,胰岛素mRNA较5.6mG对照组下降78%（P<0.01）,与相应的33.3mG无PA组比较下降56%（P<0.05）。三、不同浓度葡萄糖和PA对GPR40基因表达的影响:不同浓度的葡萄糖（5.6mmol/L、16.7mmol/L和33.3mmol/L）培养24h和48h对GPR40表达没有明显影响。在5.6mG浓度条件下加入PA培养24、48h,GPR40表达较正常对照组无显著差异;在33.3mG浓度条件下加入PA培养24小时后与5.6mG对照组相比,GPR40mRNA表达增加12%（P>0.05）,但继续培养至48h时,GPR40 mRNA表达总量下降40 %（P<0.01）。四、改变GPR40表达对胰岛素分泌和胰岛素基因表达的影响:与GPR40未干预组相比,细胞以33.3 mG +PA培养48h,GPR40 pIRESpuro转染组增强GPR40的表达后GSIS较对照组下降12%（P<0.05）,而siRNA转染组抑制GPR40的表达后高糖高脂对GSIS的抑制效应有了逆转,与未转染组细胞相比,GSIS增加了20% （P<0.05）。说明GPR40参与了PA对胰岛素分泌的长期影响。长期处于高浓度PA状态,GPR40过度激活可能增加PA对β细胞胰岛素分泌的抑制作用,损害β细胞的胰岛素分泌功能,而抑制GPR40的表达,可以减轻或逆转高脂对GSIS的抑制。siRNA转染组、GPR40-pIRESpuro转染组在5.6mG、33.3mG浓度条件下加入PA培养48h,与相对应的未转染组相比,两种转染细胞无论增强还是抑制GPR40表达,PA在5.6mG和33.3mG条件下引起的胰岛素mRNA表达变化未见显著性差异。五、改变GPR40对细胞活性和凋亡的影响:细胞在不同糖浓度条件下（5.6mmol/L和33.3mmol/L）用含有或不含有0.5mmol/L的PA处理48小时,结果显示,与5.6mG培养组相比,33.3mG培养48h,细胞活性显著降低（P<0.05）。加入0.5mmol/L PA处理48h后,5.6mG和33.3mG组INS-1细胞的活性均明显下降（P<0.05）,而33.3mG+PA组细胞活性最低,说明高糖高脂两者存在时毒性更大（ P<0.05）。siRNA和GPR40-pIRESpuro转染组33.3mG+PA培养48h,与相应条件的未转染细胞相比细胞活性没有明显的差异,说明GPR40在体外不参与PA对INS-1细胞活性的影响。分别在5.6mG和33.3mG条件下加入或不加入PA培养48小时观察细胞的凋亡率。5.6mG培养48h,细胞凋亡率为7.9%,33.3 mG培养48 h后凋亡率为10.8% （ P<0.05）。加入PA培养48h以后,5.6mG和33.3mG组凋亡比例均较无PA组显著增加,在33.3 mG组尤其明显,凋亡率分别为13.2%和24.9%（P<0.01）。siRNA转染组PA培养48h后凋亡率较无PA细胞组亦明显增加,在5.6mG和33.3mG条件下分别为11.9%和22.8%,与相应的未转染细胞组相比没有显著性差异。而GPR40-pIRES puro转染细胞PA培养48h以后33.3mG条件下细胞凋亡较相应的未转染细胞增加13%（P>0.05）。六、活性氧水平的监测:与5.6mG培养48小时相比,33mG高糖培养48h可以显著增加细胞内活性的水平（P<0.01）。加入PA培养48h,进一步增加细胞内活性氧的水平,加入PA后在5.6mG和33.3mG条件下分别较对相应糖浓度组增加20%（P<0.05）和15%（P<0.05）。siRNA转染和GPR40-pIRESpuro转染组细胞33.3mG+PA中培养48小时活性氧水平较5.6mG对照组增加46%和56%（P<0.01）,但与相同条件下未转染细胞相比差异无显著性（P>0.05）。七:PA对细胞IRS、PKB磷酸水平的影响:PA培养可以增加IRS丝氨酸磷酸化水平,抑制PKB的磷酸化;siRNA转染抑制GPR40的表达,可以降低PA诱导的IRS丝氨酸磷酸化和增加PKB磷酸化;GPR40- pIRES puro转染增强GPR40的表达,与相应糖脂浓度的未转染组比较,IRS丝氨酸磷化水平增加,PKB磷酸化水平下降。说明GPR40参与介导脂毒性诱导的β细胞胰岛素受体信号途径的损害机制。结论高糖高脂培养可以损害β细胞胰岛素分泌功能,降低胰岛素mRNA的表达,损害胰岛素信号转导系统,增加细胞的凋亡。降低GPR40的表达,可以部分改善PA对GSIS的损害作用,改善β细胞胰岛素信号传递,但对脂性凋亡没有保护作用。
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标签：型糖尿病论文; 脂毒性论文; 葡萄糖刺激的胰岛素分泌论文;