杨树PtCDD基因的原核表达及酶活分析

论文摘要

木材形成是形成层细胞分化为木质部细胞,包括细胞的膨大、次生壁沉积及细胞的程序化死亡（PCD）的过程,核酸酶是其细胞最终死亡的重要参与者之一,对它的进一步研究不但为PCD过程提供分子生物学证据,认识树木木材形成的PCD过程的特征,研究其凋亡机制是否与动物一样,还是有其自身途径,而且有助于揭示木材形成的分子基础,并回答次生壁的形成与细胞PCD的时间关系问题。因此本论文对杨树核酸酶的进一步体外表达、产物纯化、鉴定,将为揭示木材形成的PCD过程提供重要的依据,有其重要的理论价值,而且通过认识PCD过程在木材形成过程中的作用,为木材品质的改良奠定理论基础。本研究从来自毛白杨形成层区域获得的cDNA中扩增得到Ca2+依赖型DNase（PtCDD）全长基因并将其与原核表达载体pET-30b（+）相连接,成功构建了原核表达载体pET-30b（+）-PtCDDI。并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）中。通过改变各种外界环境条件,均未得到目的蛋白。表明该基因的全长表达可能会对大肠杆菌或载体本身产生重要影响,不能获得大量表达产物。通过对该基因结构的分析,克隆了该基因的催化功能域和Ca2+结合域的一部分,以期能够降低该蛋白与DNA的结合能力,使其能够在大肠杆菌体内表达。将扩增出的包含该PtCDD功能域的基因片段与原核表达载体pET-30b（+）相连接,成功构建了原核表达载体pET-30b（+）-PtCDDF,对原核表达条件进行了优化,同时对该蛋白的表达形式进行了检测,结果发现其积累并形成包涵体。对杨树PtCDD蛋白的功能域片断进行了纯化并对其活性的进行了检测,发现它确实具有消化DNA的活性。因为杨树PtCDD全蛋白属于DNase1类核酸酶,具有能够很强地与DNA结合并且无选择性地消化DNA的能力。由此推测会对大肠杆菌的DNA或自身载体DNA一起消化,导致其在大肠杆菌体内无法实现大量表达。本研究利用表达部分多肽的方法克服了这一问题,获得了纯化的多肽,为制备PtCDD抗体以及进一步研究该蛋白的作用机制奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 文献综述
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 次生维管系统的组成
• 1.1.2 次生维管系统的结构
• 1.1.3 次生维管系统的发育及调控
• 1.1.4 木质部分化的诱导
• 1.1.5 木质部分化中的细胞程序性死亡研究进展
• 1.1.6 次生壁的构建及其与PCD 的关系
• 1.1.7 细胞程序性死亡与木材形成
• 1.2 研究次生维管系统发育的实验系统
• 1.2.1 植物整体系统
• 1.2.2 细胞离体培养系统
• 1.2.3 拟南芥（Arabidopsis）系统
• 1.2.4 创伤系统
• 1.2.5 转基因植物系统
• 1.3 研究次生维管系统常用的方法
• 1.3.1 木材形成的基因组学研究
• 1.3.2 木材形成的转录组学研究
• 1.3.3 木材形成的蛋白质组学研究
• 1.4 DNASE 在PCD 中的重要性
• 1.5 本研究的立论依据及研究意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料及其来源
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 仪器与试剂
• 2.1.4 常用培养基和缓冲液的配置
• 2.2 毛白杨PTCDD 基因CDNA 的原核表达
• 2.2.1 毛白杨形成层RNA 的提取
• 2.2.2 毛白杨形成层cDNA 第一链的合成
• 2.2.3 毛白杨PtCDD 基因cDNA 编码序列的克隆
• 2.2.4 PtCDD 基因cDNA 序列分析
• 2.2.5 PtCDD 全基因原核表达载体的构建
• 2.2.6 PtCDD 基因的原核表达
• 2.2.7 PtCDD 基因原核表达条件的优化
• 2.2.8 PtCDDF 蛋白的PMF（peptide mass fingerprint）鉴定
• 2.2.9 PtCDDF 蛋白表达形式的鉴定
• 2.2.10 PtCDDF 蛋白的纯化
• 2.2.11 PtCDDF 蛋白的功能鉴定
• 3. 结果与分析
• 3.1 PTCDD 基因的研究
• 3.1.1 PtCDD 基因cDNA 编码序列全长与分析
• 3.1.2 PtCDD 基因序列同源性比较及聚类分析
• 3.2 PTCDD 全基因CDNA 的原核表达
• 3.2.1 毛白杨形成层总RNA 的提取
• 3.2.2 PtCDD 全基因cDNA 的克隆
• 3.2.3 菌落PCR 鉴定结果
• 3.2.4 原核表达载体pET-306（+）-PtCDDI 酶切鉴定
• 3.2.5 PtCDD 全基因在大肠杆菌中的表达
• 3.3 PTCDD 基因含功能域片段的原核表达
• 3.3.1 PtCDD 基因功能域片段的克隆
• 3.3.2 菌落PCR 鉴定结果
• 3.3.3 原核表达载体pET-306（+）-PtCDDF 酶切鉴定
• 3.3.4 测序结果
• 3.3.5 PtCDD 基因功能域片段的原核表达
• 3.3.6 PtCDDF 蛋白的功能鉴定
• 4. 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 杨树PtCDD 基因的克隆与序列分析
• 4.1.2 PtCDD 全基因的原核表达
• 4.1.3 PtCDD 功能域片段的原核表达
• 4.1.4 DNase 参与了PCD 过程
• 4.2 结论
• 参考文献
• 详细摘要