酯合成脂肪酶高产菌的选育及其产酶发酵调控的研究

论文摘要

非水相中脂肪酶催化的酯合成反应已广泛用于各种酯的合成,并且也成为近二十年来脂肪酶催化的研究热点。由于并不是所有的脂肪酶都能催化非水相中的酯化反应,造成了现有脂肪酶中能有效催化酯合成反应的酶并不多,必须开发新的具有高酯合成活性的脂肪酶。本文以获得高酯活性脂肪酶为目标,首先建立了一种能快速筛选具有酯合成能力脂肪酶的筛选和酶活测定方法,然后以一株根霉Rhizopus chinensis Y92为出发菌,采用离子束和亚硝基胍进行诱变,以建立的方法进行初筛,最终筛选得到一株脂肪酶高产菌R. chinensis Y92-M,并对其培养条件进行了优化。深入研究了影响具有酯合成活性脂肪酶合成的主要因素,并对该菌所产胞内脂肪酶进行了详细分析,揭示了全细胞脂肪酶水解与合成活力之间的关系,找到了控制酯合成活性脂肪酶大量合成的手段。针对丝状真菌形态变化对生产的影响,详细研究了摇瓶和发酵罐中形态变化对酶合成的影响。并将全细胞脂肪酶用于酯的合成和生物柴油的生产,具体内容和结果:（1）为了能筛选得到酯合成活性高的脂肪酶生产菌,本文建立了一种非水相中用于具有合成活性脂肪酶筛选和活力测定的新方法。该方法的原理是利用脂肪酶在正庚烷中催化对硝基苯酚棕榈酸酯（pNPP）和乙醇之间的转酯化反应,然后用NaOH溶液快速萃取生成的对硝基苯酚并在410nm检测吸光度。该法与其它已经报道的类似方法相比,所需仪器简单,底物廉价,操作简单,因此筛选效率得到了有效提高。（2）以R. chinensis Y92为出发菌,采用两轮离子束注入诱变,并结合亚硝基胍诱变,以所建立的方法作为初筛方法,以气相测定酯合成能力作为复筛方法,筛选得到一株酯合成活性显著提高的菌株R. chinensisY92-M,该菌单位菌体的合成活性由200 U/g,提高到400 U/g。（3）为了进一步提高该菌的产酶能力,对培养条件进行了优化。首先采用田口设计对培养条件进行了初步优化,对四个培养基组成因素（麦芽糖、橄榄油、蛋白胨、和K2HPO4）和四个环境因素（摇床转速、接种量、pH和装液量）进行了考察,结果分析表明环境因素对产酶影响更显著。通过响应面对培养条件进一步优化得到最优培养条件:接种量4.25×108 spores/L,橄榄油2.37% （w/v）,装液量21 mL/250mL,蛋白胨4.06% （w/v）,麦芽糖0.5% （w/v）,K2HPO4 0.3% （w/v）,摇床转速200 r/min,pH 5.5。预测全细胞脂肪酶的最大酶活产率为14349.2 U/L,验证性实验在最优条件下,R. chinensisY92-M产具有酯合成活性全细胞脂肪酶可达13875 U/L。（4）通过培养基中添加不同类型、不同量的脂肪酸或脂肪酸酯,考察了发酵过程中全细胞脂肪酶水解活性与合成活性的关系。结果表明,全细胞的水解活性受各种脂肪酸和脂肪酸酯的诱导作用并不明显,而碳链大于18的脂肪酸或者脂肪酸酯对全细胞合成活性有显著的诱导作用,最高酶活力是未加油脂的培养基条件的17倍。（5）对细胞各部分的蛋白组分的分析结果表明,胞内脂肪酶具有水解活性而不具备合成活性。膜结合蛋白具有很好的酯合成活性,同时也具有水解活性。该微生物对具有酯合成活性脂肪酶的调节既表现在酶量的调节,也表现在酶活性的调节。酶量的调节体现在具有酯合成活性的脂肪酶为典型的诱导型酶:当诱导物三甘酯添加量大于20 g/L时,能维持酶活在650 U/g,当诱导物量不足时酶活迅速下降;具有合成活性脂肪酶的高产的条件除必须有油脂添加外,细胞还必须与油脂充分接触,解除这种接触状态,酶的合成即停止。酶活性的调节则体现在全细胞水解活力的变化上:具有高合成活性的全细胞的水解活性并不高,而实际上具有合成活性的膜结合脂肪酶水解活力可达56 U/mg。对不同培养时间的细胞各部分的蛋白组分的分析,推测造成全细胞表观水解活力和合成活力不对应的原因是膜结合脂肪酶存在变构调节。（6）研究了不同三油酸甘油酯添加量对产酶的影响,提出了油脂流加策略。摇瓶中采用油脂流加方式也可以使得酶活力保持在650 U/g,酶活产率13000 U/L左右,而油脂总添加量只需15 g/L。发酵罐中的菌体生长与产酶过程和摇瓶相比存在较大差距,油脂补料发酵并不能达到摇瓶的产酶效果。（7）通过对摇瓶过程和发酵罐过程中菌丝微观和宏观形态的观测和分析,发现菌丝微观和宏观形态变化对膜结合脂肪酶的合成影响非常显著。摇瓶过程中,聚集状态（块状,球状,固定化）下的菌丝直径稍宽,菌丝生长单位多,菌丝未出现分化现象;而松散状态下的菌丝直径稍窄,菌丝体到生长后期出现分化现象,并有膈出现。聚集状态细胞的酶活力是松散状态细胞酶活的3倍,说明菌丝聚集有利于膜结合脂肪酶的合成。通过对发酵罐中菌体形态变化以及发酵液流变特性的研究,发现小球状菌丝细胞有利于产酶,而松散状菌丝细胞不利于产酶。对发酵液流变特性的测定结果表明,球状菌体下的发酵液流动性要明显好于松散状菌体,有利于油脂的分散。载体固定化同时满足了菌体形态呈聚集状和细胞必须和油脂充分接触两个酶高产的必要条件,因此固定化细胞经发酵罐培养后酶活能达到400 U/g。（8）为了验证R. chinensisY92-M所产全细胞脂肪酶在非水相中的催化能力,将该酶和两种具有高酯合成活性的商品化脂肪酶Novo435和Amano PS-C的酯合成能力进行比较,结果显示Y92-M所产全细胞脂肪酶具有很好的酯合成能力。（9）考察了该酶在正庚烷体系中催化脂肪酸乙酯的能力,当直链脂肪酸浓度为0.6 mol/L时,该酶对碳链大于6的脂肪酸有较好的选择性,转化率可达90%以上。实验结果还表明,该脂肪酶与出发菌所产脂肪酶相比,在无溶剂体系中能有效催化辛酸乙酯和油酸乙酯的合成。还考察了该酶在无溶剂体系中合成生物柴油的能力,结果表明该全细胞脂肪酶能有效催化地沟油,豆油,麻枫籽油等各种油脂生产生物柴油,转化率均在85%以上。固定化细胞也表现出很好的催化能力,摇瓶中转化率可达75%,填充柱中的转化率可达80%,而载体内部的转化率可达到88%。若能对填充柱体系进行更为系统的研究,有望实现工业化生产。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.1.1 脂肪酶简介
• 1.1.2 脂肪酶的非水相催化
• 1.2 脂肪酶的生产技术与研究进展
• 1.2.1 脂肪酶高产菌的选育
• 1.2.2 脂肪酶活力的测定与筛选方法
• 1.2.3 脂肪酶的生产
• 1.2.4 真菌脂肪酶生产的调节
• 1.2.5 具有酯合成能力的脂肪酶
• 1.3 菌体形态对丝状真菌产物形成的影响
• 1.3.1 液态发酵中真菌形态学（MORPHOLOGY）概念
• 1.3.2 菌体形态变化对发酵过程的影响
• 1.4 脂肪酶在酯合成中的应用
• 1.4.1 生物柴油生产和油脂改性
• 1.4.2 生物芳香酯生产
• 1.4.3 全细胞脂肪酶用于酯合成反应
• 1.5 本论文的主要研究内容
• 1.5.1 论文的立题意义
• 1.5.2 课题来源
• 1.5.3 论文的主要研究内容
• 第二章 具有酯合成活性脂肪酶快速筛选方法的建立*
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 分光光度法测定脂肪酶合成活性可行性的验证
• 2.3.2 扩散阻力的影响
• 2.3.3 底物浓度的确定
• 2.3.4 加酶量的确定
• 2.3.5 光度法用于全细胞脂肪酶筛选
• 2.3.6 光度法用于96 微孔板中酶活测定
• 2.4 本章结论
• 第三章 高酯合成活性脂肪酶生产菌的选育及发酵条件的研究*
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 菌种
• 3.2.3 培养基和培养条件
• 3.2.4 方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 高酯合成活性脂肪酶产生菌的诱变筛选
• 3.3.1.1 N+注入剂量的的确定
• 3.3.1.2 N+注入和亚硝基胍二次诱变
• 3.3.1.3 传代稳定性实验
• 3.3.2 培养条件对高酯活性脂肪酶生产的影响
• 3.3.2.1 田口设计对培养基进行初步优化
• 3.3.2.2 响应面对培养条件进行优化
• 3.3.2.3 R. chinensisY92-M 产全细胞脂肪酶的最佳培养条件的确定
• 3.3.2.4 R. chinensisY92-M 产全细胞脂肪酶产酶过程与出发菌之间的比较
• 3.4 本章结论
• 第四章 华根霉全细胞脂肪酶合成与调控的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 菌种
• 4.2.3 培养基和培养条件
• 4.2.4 方法
• 4.2.4.1 脂肪酶合成活力测定
• 4.2.4.2 脂肪酶水解活力测定
• 4.2.4.3 发酵体系中脂肪酸含量的测定
• 4.2.4.4 膜结合粗蛋白的制备与分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 R. chinensis Y92-M 全细胞脂肪酶的产酶机制研究
• 4.3.1.1 不同油脂及脂肪酸添加对全细胞脂肪酶生产及菌体生长的影响
• 4.3.1.2 三油酸甘油酯对全细胞脂肪酶生产及菌体生长的影响
• 4.3.1.3 油脂对经洗涤的菌丝体产脂肪酶的诱导作用
• 4.3.1.4 具有水解活性和合成活性脂肪酶在细胞中的分布
• 4.3.1.5 脂肪酶变构调节对产酶过程的分析
• 4.3.2 具有酯合成脂肪酶的生产调节
• 4.3.2.1 摇瓶中油脂添加策略对产酶的影响
• 4.3.2.2 发酵罐中油脂添加策略对产酶的影响
• 4.4 本章结论
• 第五章 两尺度菌丝形态控制在酯合成活性脂肪酶生产中的作用
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 仪器与试剂
• 5.2.2 菌种
• 5.2.3 培养基和培养条件
• 5.2.4 方法
• 5.2.4.1 脂肪酶合成活力测定
• 5.2.4.2 发酵体系中脂肪酸含量的测定
• 5.2.4.3 发酵液中糖类碳源含量测定
• 5.2.4.4 菌体形态参数测定
• 5.2.4.5 发酵液流变特性的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 不同培养条件下的菌体形态
• 5.3.2 摇瓶过程中菌体形态变化对脂肪酶生产的影响
• 5.3.2.1 菌丝微观形态及参数变化
• 5.3.2.2 发酵过程的主要参数及产酶变化
• 5.3.3 发酵罐中菌体形态对产酶的影响
• 5.3.3.1 不同菌体形态发酵过程参数及产酶变化
• 5.3.3.2 发酵过程中发酵液流变特性的变化对产酶的影响
• 5.3.4 发酵罐中利用载体固定化保持菌体形态
• 5.4 本章结论
• 第六章 R. chinensis Y92-M 全细胞脂肪酶非水相催化特性的研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 仪器与试剂
• 6.2.2 菌种
• 6.2.3 培养基和培养条件
• 6.2.4 方法
• 6.2.4.1 脂肪酶合成活力测定（Method 1）
• 6.2.4.2 脂肪酶合成活力测定（Method 2）
• 6.2.4.3 全细胞脂肪酶催化脂肪酸酯的合成
• 6.2.4.4 全细胞脂肪酶催化生物柴油的合成
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 Y92-M 全细胞脂肪酶非水相中合成活性与商品化脂肪酶之间的比较
• 6.3.2 Y92-M 全细胞脂肪酶催化脂肪酸酯的合成
• 6.3.2.1 Y92-M 全细胞脂肪酶对脂肪酸链的选择性
• 6.3.2.2 无溶剂体系中Y92-M 全细胞脂肪酶催化脂肪酸酯的合成
• 6.3.3 Y92-M 全细胞脂肪酶催化生物柴油的生产
• 6.3.3.1 Y92-M 全细胞脂肪酶催化豆油生产生物柴油
• 6.3.3.2 Y92-M 全细胞脂肪酶催化其它油酯生产生物柴油
• 6.3.3.3 固定化细胞催化生物柴油的生产
• 6.4 本章小结
• 结论与展望
• 本论文主要结论
• 展望
• 论文的创新点
• 致谢
• 参考文献
• 博士在读期间已发表（含待发表）论文