马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用

论文题目: 马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 涂亚斌

导师: 孔宪刚,童光志

关键词: 马传染性贫血病病毒,感染性分子克隆,长末端重复序列,基因,嵌合病毒,连接糖基化

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)属反转录病毒科慢病毒属,是马传染性贫血(EIA,简称马传贫)的病原体。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗,是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗,该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行,是研究慢病毒免疫预防非常有价值的模型。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列(LTR)对病毒复制有重要的调控作用,影响到病毒的繁殖动力学、组织嗜性、致病力等方面。反转录病毒的囊膜蛋白,由于其基因的高度变异性,受到病毒学研究的普遍关注,通过对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒与其亲本强毒L株前病毒全基因组核苷酸序列的比较分析,发现二者的LTR和env基因(尤其是gp90编码区)差异较大。为了研究env基因gp90在我国EIAV-DLA致弱过程中的作用,我们以EIAV强毒辽宁株(L株)接种健康马,从不同时期发热期马血清中以RT-PCR扩增包含完整S2基因和gp90基因片段;同时以EIAV-DLA接种健康驴白细胞并用RT-PCR扩增相同的基因片段,将所得的强弱毒共30个env基因gp90进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,强弱毒gp90序列存在着多个位点高度的一致性变异,所推导的氨基酸也存在19个位点极其一致性变异,这些变异包括氨基酸的点突变和插入或缺失,其中,氨基酸在极性与非极性之间的变换及氨基酸的插入和缺失造成糖基化数量非常一致的变化。在对其它慢病毒(如HIV、SIV)研究过程中发现,糖基化对病毒的细胞嗜性、毒力以及病毒逃避中和抗体的能力起到了致关重要的作用。经过序列及氨基酸的比较后发现,gp90基因V3到V5区在强毒和弱毒之间差异显著,而在各自内部相对保守,变异较小。对27个S2基因进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,S2基因中也存在着3个非常一致的点突变,没有碱基的插入或缺失。在对我国强毒EIAV-L和弱毒EIAV-DLA env基因变异研究的基础上,我们将马传贫强、弱毒gp90全长及部分(V3-V5区)分别连接到逆转录病毒载体pBABE-puro,通过转染将马传贫强、弱毒env基因整合到包装细胞系PA317中,利用抗性筛选到稳定表达细胞系;然后将马传贫强、弱毒gp90全长及V3-V5区分别连接到高效真核表达载体pcDNA3.1(+),转染293T细胞系并经抗性筛选及亚克隆后获得高效稳定表达马传贫强弱毒gp9及V3-V5区基因的细胞系,为研究gp90及V3-V5区结构与功能打下了良好的基础。然而,我们至今对弱毒疫苗的致弱机理尚不清楚。对以HIV为主的慢病毒研究表明LTR和env基因中N-连接糖基化与病毒的嗜性、感染性和抗体中和作用密切相关。我国马传染性贫血病毒强弱毒env基因之间N-连接糖基化存在明显的区别;根据强弱毒env基因变异的分析结果,构建了一系列N-连接糖基化突变分子克隆,力图对N-连接糖基化在我国马传染性贫血病毒致弱过程中的作用进行阐述,通过转染驴白细胞并盲传10代后仍未获得N-连接糖基化突变病毒,我们推测可能的原因是由于N-连接糖基化的突变均位于env基因的V3-V5区,影响了在驴白细胞上的细胞嗜性。为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,我们在已构建EIAV-DLA株感染性分子克隆和EIAV-L株前病毒DNA全基因组分子克隆的基础上,用EIAV-L株的LTR和gp90编码区分别替换EIAV-DLA株感染性分子克降的相应片段,

论文目录:

引言

一、马传染性贫血病病毒概述

1 国内外EIAV毒株及特性

2 gag基因及其编码蛋白

3 pol基因及其编码产物

4 env基因及其编码产物

4．1 表面蛋白(SU／gp90)

4．2 跨膜蛋白(TM／gp45)

5 调节蛋白及其编码区

5．1 Tat蛋白及其作用元件TAR

5．2 S2开放阅读框架(ORF)

5．3 S3开放阅读框架和Rev蛋白

5．4 EIAV的非编码区——LTR

二、慢病毒与糖基化

1 SIV与糖基化

2 HIV与糖基化

三、本研究的主要内容和意义

研究报告

实验一 EIAV-DLA株与其亲本强毒EIAV-L株env基因及S2基因变异分析

1 材料

1．1 毒株

1．2 质粒和菌株

1．3 试剂

1．4 质粒的小量提取

2 方法

2．1 驴白细胞的培养

2．2 EIAV病毒RNA的提取

2．3 强、弱毒包含完整S2和gp90基因的扩增

2．4 强、弱毒代表性gp90部分基因的原核表达载休克隆的构建

2．5 强、弱毒部分gp90蛋白的表达

3 结果

3．1 包含完整S2和gp90基因的克隆与鉴定

3．2 EIAV-DLA及EIAV-L株gp90核苷酸和氨基酸序列比较

3．3 从EIAV-L株到DLA后gp90氨基酸比较

3．4 从EIAV-L株到DLA后gp90氨基酸点突变

3．5 EIAV-DLA及EIAV-L株S2基因核苷酸和氨基酸序列比较

3．6 EIAV-DLA及EIAV-L株S2基因氨基酸变异分析

3．7 强弱毒代表性gp90部分基因的原核表达

实验二马传染性贫血强、弱毒gp90在真核细胞系中的稳定表达

1 材料

1．1 菌株及细胞系

1．2 质粒

1．3 试剂

1．4 细胞培养用试剂

1．4．1 Hank's液

1．4．2 0.25％胰酶

1．5 仪器设备

2 方法

2．1 重组逆转录病毒载体的构建

2．2 重组真核表达载体的构建

2．3 转染用质粒的纯化

2．4 重组逆转录病毒的产生

2．5 表达EIAV gp90的SP20的产生

2．6 RT-PCR检测EIAV gp90在SP-20中的表达

2．7 表达EIAV gp90的293T细胞系的产生

2．8 免疫荧光检测EIAV gp90在293T细胞系的表达

3 结果

3．1 包含强、弱毒gp90重组逆转录病毒载体的构建

3．2 包含强、弱毒gp90重组真核表达载体的构建

3．3 强、弱毒gp90重组逆转录病毒的制备

3．4 强、弱毒gp90在SP-20中的表达

3．5 表达强、弱毒gp90真核细胞系293T的筛选

实验三 EIAV一系列N-连接糖基化突变克隆和嵌合感染性分子克隆的构建及生物学特性研究

1 材料

1．1 质粒和菌株

1．2 试剂

1．3 引物的合成和克隆或者亚克隆片段的序列测定

1．4 驴白细胞的分离培养及FDD细胞、EFK细胞的培养

1．5 主要仪器

1．6 质粒的提取与纯化

1．6．1 质粒的小量提取

1．6．2 质粒的大量提取和纯化

2 方法

2．1 pOK-LTR-DLA／L、pOK-env-DLA／L和pOK-LTRenv-DLA／L嵌合分子克隆的构建

2．2 N-连接糖基化突变分子克隆的构建

2．2．1 N-191，N-236，N-246突变分子克隆的构建

2．2．2 N-191+N-236，N-191+N-246，N-236+N-246突变分子克隆的构建

2．2．3 N-191+N-236+N-246突变分子克隆的构建

2．3 转染

2．4 转录酶(RT)活性的测定

2．5 电镜观察

2．6 嵌合病毒前病毒基因组的提取

2．7 嵌合病毒前病毒基因组LTR的扩增及测序

2．8 动物试验

2．9 血清抗体的检测

3 结果

3．1 重组质粒pOK-LTR-DLA／L的构建

3．2 重组质粒pOK-env-DLA／L的构建

3．3 重组质粒pOK-LTRenv-DLA／L的构建

3．4 N-191，N-236，N-246突变分子克隆的获得

3．5 N-191+N-236，N-191+N-246，N-236+N-246突变分子克隆的获得

3．6 N-191+N-236+N-246突变分子克隆的获得

3．7 马传染性贫血病毒感染性分子克隆衍生病毒的获得

3．8 嵌合病毒LTR的扩增及鉴定

3．9 人工感染马临床表现及血清学检测

讨论

1 EIAV env及S2基因变异及其生物学意义

2 LTR变异对EIAV毒力及细胞嗜性的影响

3 EIAV env基因点突变对病毒的复制影响及其它结构蛋白特异性抗体对试验马致病性的影响

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介

发布时间: 2005-09-05

参考文献

[1].马传染性贫血病毒LTR嵌合克隆生物学特性的研究[D]. 魏丽丽.东北农业大学2005

马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用

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