动态观察弓形虫速殖子对小鼠小肠黏膜的粘附和侵入以及体内移行过程

论文摘要

目的本研究首先动态观察弓形虫速殖子对小鼠小肠黏膜组织尤其是小肠上皮细胞的粘附和侵入;然后观察弓形虫速殖子经口感染后在小鼠体内各主要脏器的移行和组织内分布。探讨弓形虫经口感染穿越小肠黏膜屏障及体内播散的机制,以期加深对弓形虫致病机制的理解,为弓形虫黏膜疫苗抗感染机制的研究提供实验依据和理论基础,为预防和治疗弓形虫感染开拓新思路。方法本研究分三部分:第一部分:7～8周龄BALB/c小鼠30只随机分为感染组和对照组。感染组小鼠每只灌胃接种含2×104个弓形虫速殖子的PBS 0.2 ml,对照组给予等量的PBS。分别于感染后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h和8 h处死感染组小鼠4只和对照组小鼠1只,取十二指肠、空肠、回肠制备石蜡切片,RNA原位杂交。第二部分:将弓形虫速殖子和IEC-6于24孔培养板内盖玻片上共培养,倒置显微镜动态观察速殖子的黏附、侵入和增殖过程。分别于共培养5 min、10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h后取出盖玻片,姬-瑞氏染色,光镜观察侵入、增殖情况,并计数侵入率。第三部分:7～8周龄BALB/c小鼠30只随机分为感染组和对照组。感染组小鼠每只灌胃感染含2×104个弓形虫速殖子的PBS 0.2 ml,对照组用等量的PBS灌胃。分别于灌胃后1 d、2 d、4 d、6 d和8 d处死感染组小鼠4只和对照组小鼠1只,取肠系膜淋巴结（MLN）、肝、脾、肺和脑组织,制备石蜡切片,采用地高辛标记的弓形虫速殖子SAG2 mRNA特异性寡核苷酸探针,进行RNA原位杂交检测速殖子在组织内的分布。结果经口感染后15 min,速殖子到达小肠组织,速殖子可位于小肠上皮细胞（吸收细胞、杯状细胞和内分泌细胞）的纹状缘,吸收细胞胞浆内或相邻吸收细胞之间及固有层内。感染后15 min～2 h,粘附于空肠的速殖子数显著高于回肠（P<0.05）;感染后15和30 min,侵入空肠的速殖子数显著高于十二指肠和回肠（P<0.05）。随着感染后时间的延长,速殖子粘附于各肠段的数量逐渐减少,侵入的数量逐渐増多。较感染后15 min,8 h所有肠段粘附的速殖子数显著减少（P<0.05）,而4 h和8 h侵入的数量显著增加（P<0.05）。感染后8 h侵入空肠和回肠的数量显著高于4 h（P<0.05）。体外细胞共培养实验显示:共培养5 min弓形虫速殖子既可侵入IEC-6细胞,侵入率逐渐升高,1 h为55.00 %±6.59,胞内虫体数量为1～5个;2 h侵入率最高,达81.80 %±10.16,同时有假包囊的形成,4 h假包囊破裂,释放出速殖子;48 h无贴壁细胞存在,有大量游离速殖子。经口感染后1 d,速殖子出现于MLN、肝、脾组织内;感染后2 d,MLN、肝、脾组织内的速殖子形成假包囊;感染后4 d速殖子可见于肺内;感染后6 d,速殖子移行至脑组织,于脑组织内偶见假包囊。感染早期,MLN、肝、脾组织血管及淋巴管周围可见少量虫体,随后,虫体分布于整个MLN、肝、脾及肺内。随着感染时间的推移,MLN、肝、脾、肺和脑组织内的虫荷均显著增加（P<0.05）。感染后第6 d及8 d,组织内虫荷顺序为:MLN>肝>脾>肺>脑。结论感染后15 min,速殖子已粘附和侵入小肠黏膜,粘附无细胞选择性,而侵入具有部位选择性,空肠为速殖子的易感部位。感染后8 h小肠固有层内大量的速殖子可能是由于增殖所致。IEC-6是弓形虫的适宜靶细胞,速殖子在体外可迅速侵入IEC-6细胞,并可在细胞内增殖,增殖周期为6～12 h。经口感染后,弓形虫速殖子穿越小肠黏膜屏障,首先侵入MLN,提示其可由小肠经淋巴循环播散至其他脏器;速殖子在机体内移行的顺序为:肠系膜淋巴结→肝、脾→肺→脑。经口感染RH株速殖子可在24h内于组织中形成假包囊,趋势曲线表明,各组织内虫荷随时间的延长而逐渐增加,且虫体在MLN内增殖较快。

论文目录

• 缩略词
• 摘要
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• ABSTRACT
• 第一章 实验一 RNA 原位杂交法动态观察弓形虫速殖子在小鼠小肠黏膜的粘附及侵入
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二章 实验二 弓形虫速殖子体外对 IEC-6 细胞侵入与增殖的动态观察
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三章 实验三 RNA 原位杂交法观察急性感染弓形虫在小鼠组织内的动态分布
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第四章 文献综述
• 肠黏膜免疫抗弓形虫感染作用研究进展
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢
• 个人简历