基因芯片技术用于流感病毒检测与致病力鉴别的研究

论文摘要

流感病毒具有易变异、易重组的特点,被认为是人类面临的最持久和最重要的威胁之一,历史上四次流感大流行均是由流感病毒的重配株或是变异株引起的。目前H5N1高致病性禽流感病毒所导致的高病死率所引发的公共卫生问题更是引起了国际社会的高度重视,及时、准确的发现病毒已成为有效防控人禽流感疫情的前提,因此本文的研究目的就是根据目前禽流感防控形势的需要,建立针对多种常见流感病毒和人禽流感病毒的快速、准确、高通量的基因芯片检测技术平台,为临床鉴别、诊断及防生反恐等提供快速、有效的检测手段。本文选取H1N1、H3N2和B型三种常见季节性流感病毒以及H5N1、H9N2两种人感染禽流感病毒作为检测靶病毒。以血凝素基因、神经氨酸酶基因、核蛋白基因作为检测靶基因,设计和筛选亚型特异性探针和致病力鉴别探针。比较单引物扩增、随机引物扩增、体外转录三种RNA扩增方法的扩增效率,确定样品处理方法。在此基础上,确定此基因芯片检测体系的Cutoff值,评价方法的特异性、灵敏性、重复性及符合率等技术指标。结果表明,此基因芯片能够特异的检测到5种靶病毒,并且5种病毒之间无交叉反应。对H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型及B型流感病毒检测敏感性分别为8HAU、16HAU、4HAU、8HAU和32HAU,高致病力鉴别探针敏感性为32HAU。同时此检测芯片具有良好的重复性。对56例流感样病例样本进行检测,与常规RT-PCR法比较,符合率达到83.9%（47/56）,其中阳性符合率为82.7%（43/52）。本研究建立的流感病毒基因芯片检测技术能够鉴别、检测常见的5种流感病毒,并且可以对病毒的致病力进行检测。该检测技术重复性好、特异性好、敏感性较高,适应大规模、高通量和平行检测的要求,有效解决了现有检测技术不能一次试验同时检测多种亚型流感病毒的问题。为应对紧急突发事件提供了一种重要的技术手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 流感病毒简介
• 1.1.1 流感病毒的生物学特性
• 1.1.2 流感病毒的变异
• 1.1.3 流感病毒的危害
• 1.1.4 流感病毒的诊断方法
• 1.2 基因芯片技术
• 1.2.1 基因芯片技术的原理
• 1.2.2 基因芯片的优势
• 1.2.3 基因芯片的应用
• 1.3 研究意义
• 第2章 基因芯片技术用于流感病毒检测与致病力鉴别的研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病毒株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 实验主要器材与试剂
• 2.1.5 部分试剂的配制
• 2.1.6 引物和探针的设计与合成
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 病毒RNA 的提取
• 2.2.2 样品RNA 的扩增
• 2.2.3 样品的标记
• 2.2.4 基因芯片的制备
• 2.2.5 基因芯片的杂交
• 2.2.6 基因芯片的扫描和结果分析
• 2.2.7 基因芯片的性能评价
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 病毒鉴定
• 2.3.2 探针筛选
• 2.3.3 芯片制备
• 2.3.4 病毒RNA 扩增方法的比较
• 2.3.5 基因芯片检测特异性
• 2.3.6 Cutoff 值的确定
• 2.3.7 基因芯片检测的敏感性
• 2.3.8 基因芯片检测的重复性
• 2.3.9 基因芯片检测的符合率
• 2.4 讨论
• 2.4.1 检测靶病毒的选取
• 2.4.2 基因芯片探针的设计
• 2.4.3 病毒RNA 的扩增
• 2.4.4 芯片特异性评价
• 2.4.5 Cutoff 值的确定
• 2.4.6 芯片敏感性评价
• 2.4.7 芯片重复性评价
• 2.4.8 芯片符合率评价
• 第3章 结论与展望
• 3.1 本研究的工作总结
• 3.2 本研究的创新点
• 3.3 本研究不足之处
• 3.4 有待于进一步开展的工作
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 流感毒株名称
• 附录B 探针序列
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况