小鼠子宫蜕膜基质细胞生物学特性及其对树突状细胞增殖影响的研究

论文摘要

目的:1.拟建立稳定的小鼠子宫蜕膜基质细胞（decidual stromal cell, DSC）培养方法,观察DSC形态特征和生物学特性。2.在体外建立稳定的从小鼠骨髓来源的单核细胞诱导成熟树突状细胞（dendritic cell, DC）的培养体系,观察DC形态特征和生物学特性。3.建立细胞共培养模型,初步探讨小鼠蜕膜基质细胞对成熟DC增殖的影响,为进一步研究DC在诱导母胎免疫耐受中的作用打下良好的基础。方法:1.选用孕龄6-8d的C57BL/6孕鼠蜕膜组织,采用胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶混合消化,进行蜕膜基质细胞体外培养。倒置显微镜观察细胞形态学变化;催乳素（prolactin, PRL）免疫组织化学染色进行细胞鉴定;RT-PCR检测DSC表达的细胞因子和趋化因子。2.应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）和白细胞介素-4（interleukin 4,IL-4）诱导培养小鼠骨髓细胞,相差显微镜观察形态学变化;FACS检测细胞表面分子;3H-TdR掺入法检测DC刺激同种异体或同体T细胞增殖能力;ELISA检测其分泌的细胞因子。3.采用小鼠子宫DSC和成熟DC共培养技术,建立细胞共培养模型,观察DSC对DC增殖的影响。结果:1.小鼠子宫DSC在接种24h后大部分已贴壁,贴壁生长的细胞成纤维母细胞状, 5-7d后细胞融合成单层。每4-5d传代1次,传代的细胞形态无明显变化,而传代培养极性渐不明显。PRL免疫组化显示体外培养传代后95%阳性细胞为蜕膜基质细胞,细胞大小形状均一,染色特点为胞质内可见细小的棕色颗粒,且越近胞核染色越深。RT- PCR检测DSC表达GM-CSF、血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor,VEGF）、白介素-2（interleukin 2, IL-2）、白介素-10（interleukin-10, IL-10）等细胞因子;表达单核细胞趋化蛋白-2（Monocyte chemotactic protein-2, MCP-2）、单核细胞趋化蛋白-3（Monocyte chemotactic protein-3, MCP-3）、胸腺活化相关的趋化性因子（Thymus activation-related chemokine,TRAC）等趋化因子。2.用GM-CSF+ IL-4细胞因子联合培养3d后,有细胞集落形成;培养第5d开始,一部分细胞从集落脱落,悬浮于培养基中,呈现树枝状不规则变化;脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导后,成簇的细胞散开,大量的细胞脱落,多数为圆形或不规则形,表面有丰富的伸长毛刺的低密度大细胞。成熟DC高表达DC相对特异性标志CD11c、共刺激分子CD80、CD86、MHCⅡ类分子Ia和Ⅰ类分子H-2Kb。DC具有强烈的激活T细胞增殖的能力;1000个DC,即可有效激发T细胞增殖。LPS刺激成熟8d DC与未经LPS刺激5d DC,其刺激同种异体或同体T细胞增殖能力明显增高,结果比较差异有统计学意义（P<0.05）。并且在各组中随着DC:T比例增加,其刺激T细胞增殖能力增强,结果比较差异有统计学意义（P<0.05）。经LPS刺激的成熟DC分泌细胞因子IL-12p70、IL-6、TNFa和IL-1b的水平明显升高,与未经LPS刺激的PBS组结果比较差异有统计学意义（P<0.05）。3.成熟DC能在DSC单层上继续生长,没有随着培养时间的延长而走向自然凋亡,第15d镜下观察形成细胞集落,发生了克隆性增殖。结论:1.建立的混合酶消化全组分蜕膜的方法,简化了DSC的提纯程序,能获得高纯度的合乎实验要求的DSC,具有经济、实用、方便、可靠的特点。2.细胞因子组合GM-CSF+IL-4+LPS在体外具有诱导小鼠骨髓来源的单核细胞分化为成熟DC的作用,我们建立的体外诱导小鼠骨髓单核细胞的方法可以获得形态、表型和功能都非常典型的成熟DC,方法简便。3.小鼠子宫DSC组成的微环境能逆转成熟DC的自然凋亡,使其重新获得增殖的能力。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 小鼠子宫蜕膜基质细胞生物学特性的研究
• 材料与方法
• 结果
• 第二部分 小鼠蜕膜基质细胞对骨髓来源成熟树突状细胞增殖的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 读硕士期间参与的主要科研项目