玉米α-淀粉酶抑制剂的分离纯化及性质研究

论文摘要

α-淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor,α-AI）,是一种天然生物活性物质,因为对昆虫消化道、哺乳动物唾液及胰淀粉酶具有特殊的抑制活性,被称为“淀粉阻断者”（starch blocker）。因此,α-AI被用于医疗、农业以及酶工程等各个领域。本试验研究目的是筛选α-AI含量较高的玉米品种,确定提取玉米α-AI的关键技术参数,建立玉米α-AI的纯化工艺,并对所得玉米α-AI理化性质及动力学进行了初步分析。1.玉米α-AI提取的研究。20个玉米品种中筛选出α-AI含量较高的品种作为实验原料。采用单因素实验研究了提取液、浸提时间、浸提温度、浸提液盐浓度、浸提液pH、浸提液料比、离心机转速等8个因素对玉米α-AI提取率的影响。通过皮尔逊相关性、方差分析确定出对玉米α-AI提取率影响显著的几个因素,利用二次正交旋转组合试验确定出玉米α-AI的最佳提取工艺参数。研究结果表明:试验C272玉米品种α-AI含量最高;最佳提取工艺参数为:0.02 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液中,NaCl浓度为0.15 mol·L-1,浸提液料比4.3:1,浸提液pH 6.9,浸提时间3.2 h,玉米α-AI的提取率为22.162 AIU·g-1,验证实验达到21.996 AIU·g-1;硫酸铵在35%～65%饱和度时分离玉米α-AI效果最佳。2.玉米α-AI分离纯化工艺及其技术参数的优化。通过对玉米α-AI进一步分离纯化,获得较高纯度的玉米α-AI,并确定了简单可行的纯化工艺技术。使用DEAE-Sephadex A-25和D301、D315、DCF-5等离子交换介质进行静态吸附试验,确定最适柱材;对洗脱液及洗脱方式、填料高度进行试验,用L9（34）正交试验对填料高度、流速、进样浓度及进样量这四个因素进行最佳试验条件优化,确定最佳分离条件;采用SephadexG-75凝胶过滤对纯化的玉米α-AI进行分离脱盐,最后采用SDS-PAGE、HPLC对α-AI纯度进行鉴定。结果显示,将DEAE-Sephadex A-25作为填充介质吸附玉米α-AI效果最好,在流速30 mL·h-1,填料高度为28 cm,进样浓度为2.0 mg·mL-1,进样体积为1.5 mL时,玉米α-AI纯化效果理想;通过SephadexG-75凝胶过滤色谱进一步脱盐处理,可以达到纯度为388.2 AIU·mL-1的玉米α-AI制品,回收率为33.2%。经HPLC测定,玉米α-AI的浓度为33.32 mg·mL-1。3.玉米α-AI的性质研究。通过对所提玉米α-AI的性质分析,确定此玉米α-AI的是一种非竞争性抑制剂,抑制常数Ki为8.0×10-4mol·L-1;它的最适pH是6.8,pH在6.0～7.0较稳定;热稳定性较好,在100℃下作用40 min仍有较高的抑制活力;专一性检测得知这种抑制剂不仅对猪胰淀粉酶有一定的抑制作用,而且对玉米螟淀粉酶、人唾液淀粉酶也有一定的抑制作用;电镜扫描检测结果表明,所提玉米α-AI的表面结构与玉米粉结构完全不同;PAGE及SDS-PAGE电泳测定确定该玉米α-AI由一个亚基组成,相对分子量为17.9 KDa;聚丙烯酰胺等电聚焦电泳测定该玉米α-AI等电点是5.96。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 引言
• 1.1 α-AI 的概述
• 1.1.1 α-AI 的类型
• 1.1.2 α-AI 的资源分布及主要性质
• 1.1.3 α-AI 作用机理及生物活性
• 1.2 α-AI 的应用领域
• 1.2.1 临床医学方面的应用
• 1.2.2 农业生产及植物保护方面的应用
• 1.2.3 新型保健品的开发
• 1.3 α-AI 分离纯化技术的发展现状
• 1.4 课题研究的目的意义
• 1.5 研究内容
• 1.5.1 玉米α-AI 粗提工艺的研究
• 1.5.2 玉米α-AI 纯化工艺的研究
• 1.5.3 玉米α-AI 的理化性质以及动力学研究
• 第二章 玉米α-淀粉酶抑制剂提取工艺研究及其技术参数优化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 原材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 试剂的配制
• 2.2.2 检测方法
• 2.2.3 技术路线
• 2.2.4 原料预处理
• 2.3 实验内容与结果分析
• 2.3.1 绘制蛋白质标准曲线
• 2.3.2 麦芽糖标准曲线的绘制
• 2.3.3 玉米α-AI 含量的测定与分析
• 2.3.4 玉米α-AI 提取条件的优化及分析
• 2.3.5 玉米α-AI 粗液等电点的测定
• 2.3.6 盐析实验与分析
• 2.3.7 透析脱盐
• 2.3.8 真空冷冻干燥
• 2.4 验证实验
• 2.5 本章小结
• 第三章 玉米α-淀粉酶抑制剂纯化工艺的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 原材料
• 3.1.2 仪器设备
• 3.1.3 试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 试剂的配制
• 3.2.2 实验路线
• 3.2.3 玉米α-AI 粗品的制备
• 3.2.4 等电点沉淀法制备玉米α-AI
• 3.2.5 检测方法
• 3.3 实验内容与结果分析
• 3.3.1 阴离子交换色谱纯化α-AI 实验与分析
• 3.3.2 凝胶过滤色谱纯化玉米α-AI 实验与分析
• 3.3.3 纯化玉米α-AI 验证实验与结果分析
• 3.3.4 SDS-PAGE 电泳检测与分析
• 3.3.5 纯化效果
• 3.4 本章小结
• 第四章 玉米α-淀粉酶抑制剂的性质研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 原材料
• 4.1.2 仪器设备
• 4.1.3 试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 试剂的配制
• 4.2.2 检测方法
• 4.3 实验内容与结果分析
• 4.3.1 等电聚焦测玉米α-AI 的等电点
• 4.3.2 玉米α-AI 的相对分子量及亚基数的测定
• 4.3.3 预热时间对玉米α-AI 的影响
• 4.3.4 温度对玉米α-AI 活力的影响
• 4.3.5 玉米α-AI 的最适pH 的测定
• 4.3.6 玉米α-AI 的酸稳定性的测定
• 4.3.7 玉米α-AI 的专一性测定
• 4.3.8 玉米α-AI 的氨基酸含量测定
• 4.3.9 玉米α-AI 的结构分析
• 4.4 玉米α-AI 的动力学分析
• 4.4.1 猪胰α-淀粉酶米氏常数的测定
• 4.4.2 玉米α-AI 的抑制动力学研究
• 4.5 不同玉米品种抑制剂含量与总蛋白质含量相关性分析
• 4.6 本章小结
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 本课题创新之处
• 5.3 建议
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历