ICAM-1靶向超声分子成像在晚时间窗对心肌缺血事件的诊断评估

论文摘要

背景和目的心内科门诊病人中主诉胸痛者较多。对于胸痛发作中的病例,心电图对判断事件是否为心肌缺血引起有较大价值,如果是心肌梗死,则心电图结合酶学检查多可确诊。但实际上仅少数病人能在胸痛事件发作时就医,多数在发病数小时甚至数天后才能就诊。要判断这部分病人的胸痛事件是否由心肌缺血引起,心电图、酶学和普通超声等常规检查举证乏力。另外,症状不典型的心肌缺血患者越来越多,由于缺少合适的筛选手段,容易导致漏诊和误诊。近年来,随着靶向超声微泡造影剂的出现,靶向超声分子显像逐渐成为现实,可望从分子水平对多种疾病进行早期诊断。血管内皮损伤/炎症普遍存在于冠心病、高血压及心力衰竭等心血管疾病中,并与它们的发生、发展及预后密切相关。心脏对缺血再灌注（ischemia-reperfusion,IR）十分敏感。缺血可使大量粘附分子表达于血管内皮表面,它们在缺血事件结束后的一段时间内持续存在,被称为炎症“分子记忆”（molecular memory）。有学者通过靶向P-选择素行超声分子成像,在缺血后1 h的早期时间窗内成功找到了缺血事件的证据。但临床上多数病人无法在胸痛发作1 h内及时就诊,如何在晚时间窗里对其做出诊断,是一项颇具研究价值和实用价值的课题。细胞间粘附分子-1（ICAM-1）在生理状态下,内皮表达量很低,但在缺血事件或心衰时会明显增高,可持续数天或更久。因此,我们假定ICAM-1在缺血事件发生后的晚时间窗可作为超声靶向分子对缺血事件进行诊断。本研究的目的是通过生物素桥连作用构建出携抗ICAM-1单抗的靶向微泡(MBICAM),并在小鼠心肌IR模型上应用MBICAM和携同型抗体的对照微泡(MBISO)行对比超声检查,探讨MBICAM分子靶向技术在缺血事件晚时间窗里寻找分子记忆证据的可行性,以期为冠心病的分子靶向诊断技术提供研究基础。方法对50只昆明小鼠（雄性,25～30 g）开胸,在左心耳下1-2 mm处结扎前降支使左室前壁缺血15 min后再灌注,制作IR模型,或开胸只在前降支部位过线,不结扎,制作假手术（sham surgery,SH）组,或不开胸的正常组（Normal）。IR模型依据再灌注时间不同分为:IR-1h、IR-8h和IR-24h三组,每组5只,分别行TTC（氯化三苯基四氮唑）染色和HE染色观察心肌存活状况和组织学改变、行免疫组化检查寻找炎性“分子记忆”证据、心电图确定缺血表现、M型超声检测心脏形态和功能变化、ELISA法测定血浆肌钙蛋白（TnI）。生物素桥连法构建携抗ICAM-1单抗靶向微泡(MBICAM)和携同型抗体的对照微泡(MBISO)。库尔特计数仪、荧光标记、平行板流动腔在体外分别评价微泡物理性能、抗体结合情况以及黏附效能。心肌对比超声（contrast-enhanced ultrasound,CEU）检查寻找缺血事件的分子记忆图像。结果TTC染色显示缺血15 min后的再灌注心肌无明显坏死,而HE染色显示所有IR组心肌组织均可见不同程度的细胞肿胀及白细胞增多,提示即使是没造成心肌坏死的缺血事件也会留下炎症性改变的证据,这种改变在活体上不便采用组织学检查的手段来确定,那么寻找分子生物学的诊断证据便是有力的候选途径。免疫组化检查显示,IR-8h组和IR-24h组缺血区血管内皮ICAM-1表达明显增加,特别是IR-24h组最为明显,而IR-1h组和正常组相应区域血管内皮无明显ICAM-1表达,表明心肌缺血事件后的晚时间窗记忆分子确实存在。M型超声检查发现,IR-1h组和IR-8h组与相应的假手术组相比左室短轴缩短率（LV%FS）存在明显差异（P＜0.01）,而IR-24h组与对应假手术组相比,LV%FS无显著差异。这说明在缺血8 h内,会留下心功能受损的证据,但24 h后,心功能恢复,普通心脏超声无法再提供诊断证据。心肌TnI检测显示各再灌注时间点上,手术组与假手术组的浓度无显著差异,提示酶学检查不足以为无心肌坏死的缺血事件提供有力诊断依据。微泡制备结果:MBISO平均粒径为2.07±1.13μm,浓度约为1.5±0.31×108个/ml;MBICAM平均粒径2.08±0.85μm,浓度约1±0.39×108个/ml。荧光显微镜下MBICAM外壳显示明亮的绿色荧光;平行板流动腔示,在模拟微血管血流生理剪切应力下（＜1.0 dyn/cm2）,MBICAM与ICAM-1抗原可高效结合。分子靶向心肌对比超声结果:尾静脉注入MBICAM微泡进行对比超声检查发现IR-8h和IR-24h组的左室前壁缺血区与左室后壁的非缺血区相比,前者的心肌显影明著增强,而IR-1h组前壁仅轻度增强,正常组前壁则无明显显影;对照微泡MBISO在各再灌注组的左室前壁缺血区仅见轻度的超声显影。对图像行定量分析后发现IR-8h和IR-24h组在左室缺血前壁的MBICAM声强度（Ⅵ）明显高于非缺血的后壁,也明显高于对照微泡MBISO在前壁的Ⅵ值（P＜0.01）;在IR-1h组,MBICAM与MBISO在前壁的Ⅵ值无明显差异;在正常组,则两种微泡在不同部位的Ⅵ值均无明显差异。这些结果表明靶向ICAM-1分子的MCE能在再灌注8-24 h的晚时间窗有效探查缺血事件的证据。结论应用携抗ICAM-1单抗靶向微泡(MBICAM)行CEU检查产生分子记忆图像,可在再灌注晚时间窗（8 h）有效探查小鼠缺血心肌,并且这种评价能力可以高效维持到24 h或更久。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 方法
• 一、实验动物及材料
• 二、实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 缩略词表
• 课题资助基金
• 致谢
• 统计学证明