人Hepcidin融合表达载体的构建、在大肠杆菌中的表达及制备研究

论文题目: 人Hepcidin融合表达载体的构建、在大肠杆菌中的表达及制备研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化工

作者: 张怀

导师: 马润宇,袁其朋

关键词: 大肠杆菌,融合蛋白,标签,表达,包涵体

文献来源: 北京化工大学

发表年度: 2005

论文摘要: Hepcidin是一个主要在肝脏表达的含8个半胱氨酸残基的小分子多肽,是机体铁稳态调控途径中关键性的效应分子,其主要生物学功能在于调节小肠上皮细胞对于铁的吸收。另外,hepcidin和许多富含半胱氨酸的抗菌肽类似具有显著的抗菌作用。本文采用大肠杆菌表达体系进行了人hepcidin的融合表达,并对重组hepcidin的生产工艺进行了研究。 根据hepcidin氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏好性,化学合成了人hepcidin的基因序列,并在hepcidin编码序列的5′端引入了肠激酶特异性识别位点序列。我们首先构建了hepcidin的GST融合表达载体pGEX-hpc。尽管pGEX-hpc在25℃表达的GST-hepcidin 50%为可溶蛋白,但可溶蛋白不能采用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析进行纯化。在载体pGEX-hpc的基础上构建了表达载体pET-hpc,pET-hpc表达的融合蛋白His-hepcidin大小为10.6kDa,N端带有6×His标签,并且其N端的担体序列中不含有半胱氨酸,hepcidin在His-hepcidin中所占比例为26.6%。采用His-hepcidin进行hepcidin的制备。 载体pET-hpc在E.coli BL(DE3)中表达的His-hepcidin融合蛋白以包涵体的形式存在。His-hepcidin诱导表达时,温度是影响蛋白表达水平和菌体生长的最主要因素。确定的His-hepcidin诱导表达条件为:含pET-hpc的E.coli BL(DE3)在37℃生长至OD600为0.6～0.8后加入0.2mmol/L IPTG于30℃诱导表达6h。表达后菌体收率为6.1g/L(湿重),His-hepcidin约占菌体总蛋白的25%。收获的菌体经超声破碎后离心分离His-hepcidin包涵体,采用1%浓度的Triton X-100洗涤2次,洗涤后包涵体收率为0.99g/L(湿重),其中包涵体中重组蛋白占总蛋白的76%,His-hepcidin产率为199mg/L。包涵体中半胱氨酸残基主要以还原形式存在,采用含100mmol/L β-ME的8mol/L尿素溶解包涵体。

论文目录:

第一章 文献综述

1.1 机体中铁的功能

1.2 铁缺乏和过量对人体的危害

1.3 Hepcidin与机体铁代谢

1.3.1 Hepcidin的分子结构

1.3.2 机体内正常铁代谢

1.3.3 人体内铁代谢调节

1.3.4 Hepcidin在铁代谢调节中的作用

1.3.5 Hepcidin的表达调控

1.3.6 Hepcidin的应用前景与制备方法

1.4 大肠杆菌表达体系

1.4.1 大肠杆菌表达载体

1.4.2 大肠杆菌密码子偏好性

1.4.3 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位

1.4.4 融合表达

1.4.5 大肠杆菌的培养

1.5 论文的研究思路

第二章 Hepcidin融合蛋白表达载体的构建

2.1 DNA序列的设计与合成

2.2 Hepcidin融合蛋白表达载体构建

2.2.1 菌株与质粒

2.2.2 试剂

2.2.3 培养基

2.2.4 仪器设备

2.2.5 pGEX-hpc融合蛋白表达载体构建

2.2.6 pET-hpc融合表达载体构建

2.3 结果与分析

2.3.1 Hepcidin合成与天然序列的比较

2.3.2 pGEX-hpc融合表达载体的的构建与鉴定

2.3.3 pET-hpc载体的的构建与鉴定

2.4 讨论

2.4.1 Hepcidin基因的克隆策略

2.4.2 目的基因的表达策略

第三章 Hepcdin融合蛋白在大肠杆菌中的表达

3.1 菌株与质粒

3.2 试剂

3.3 培养基

3.4 仪器设备

3.5 实验方法

3.5.1 pGEX-hpc在大肠杆菌的表达

3.5.2 pET-hpc在大肠杆菌中的表达

3.6 结果与讨论

3.6.1 GST-Hepcidin的表达

3.6.2 His-hepcidin蛋白表达

3.7 本章小结

第四章 包涵体的分离纯化及金属螯合亲和层析

4.1 材料与设备

4.1.1 表达菌株

4.1.2 试剂

4.1.3 实验设备

4.2 实验方法

4.2.1 蛋白表达

4.2.2 包涵体的制备

4.2.3 包涵体的溶解

4.2.4 金属螯和层析

4.2.5 螯合树脂吸附容量测定

4.2.6 吸附动力学实验

4.2.7 其他实验方法

4.3 结果与分析

4.3.1 包涵体的分离与洗涤

4.3.2 包涵体的溶解

4.3.3 金属螯合层析

4.3.4 螯合树脂吸附容量及吸附动力学

4.4 本章小结

第五章 融合蛋白的二硫键形成与复性

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.2.1 二硫键的氧化形成

5.2.2 氧化蛋白质的浓缩

5.2.3 氧化蛋白单体的分离

5.2.4 氧化蛋白单体的复性

5.2.5 单体蛋白的浓缩

5.2.6 缓冲溶液更换

5.2.7 单体蛋白的分析

5.3 结果与分析

5.3.1 二硫键的形成

5.3.2 氧化蛋白的浓缩

5.3.3 氧化蛋白的分离

5.3.4 单体蛋白的复性

5.3.5 单体蛋白的浓缩

5.3.6 缓冲液更换

5.4 本章小结

第六章 肠激酶酶切反应及hepcidin纯化

6.1 材料与设备

6.1.1 实验材料

6.1.2 仪器与设备

6.2 实验方法

6.2.1 融合蛋白酶切反应

6.2.2 IMAC吸附

6.2.3 Hepcidin的纯化

6.2.4 园二色光谱

6.2.5 抗菌试验

6.3 结果与分析

6.3.1 酶切反应条件

6.3.2 担体蛋白的去除

6.3.3 Hepcidin的反相纯化

6.3.4 重组hepcidin的抑菌效果

6.4 本章小结

第七章 融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE

7.1 试剂和仪器

7.2 实验方法

7.3 结果与分析

7.3.1 电泳样品中还原剂浓度对电泳的影响

7.3.2 凝胶中还原剂浓度对电泳的影响

7.4 本章小节

第八章 总结

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

发布时间: 2005-09-26

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