论文摘要
甘露糖受体（Mannose Receptor,MR）又称CD206,是MR家族成员之一,属C-型凝集素受体,最早发现于大鼠肝枯否细胞,后发现广泛存在于动物体内的多种细胞,主要生物学功能表现在介导内吞清除内外源的多糖,多肽,蛋白,核酸和杀灭病原体,转运和递呈抗原启动免疫应答,是保守的模式识别受体（Pattern Recognition Receptor,PRR）之一。MR的分子量为175kDa,属I-型跨模蛋白,胞外部分分为N-末端的富含半胱氨酸结构域（Cysteine-rich Region,CR）, II-型纤连蛋白重复结构域（Fibronectin Type II Repeat Region,FN II）,8个C-型凝集素样糖识别结构域（C-Type Lectin like Domain,CTLD1-8）,跨膜结构域和胞浆的C-末端序列。MR可通过不同的结构域识别结合多种配体。据报道,表达在淋巴管内皮细胞上的MR是L-选凝蛋白的天然配体,两者的相互作用介导了淋巴细胞的归巢。本实验室的前期工作表明小鼠肝癌细胞高低淋巴道转移株HCa-F和HCa-P的淋巴道转移潜能与其表达的L-选凝蛋白正相关,此外,发现淋巴瘤细胞p388D1的淋巴道转移潜能也与其表达的L-选凝蛋白相关。故认为MR与L-选凝蛋白存在的相互作用可能介导肿瘤的淋巴道转移,转移机制与淋巴细胞的“归巢”相似。实验目的:利用DNA重组技术将甘露糖受体MR的C-型凝集素样糖识别结构域4-7（CT- LD4-7）与分泌性信号肽Sig和人IgG的Fc段构成嵌合基因,插入到真核表达载体pCDNA3.1中,瞬转293T细胞,检测蛋白表达,为以后利用Protein-A亲和层析纯化蛋白,进行黏附实验来验证甘露糖受体MR与L-选凝蛋白相互作用,以及究其相互作用与肿瘤淋巴道转移的相关性提供基础。实验方法:1.酶切鉴定本实验室已有的连接有MR CTLD1-8序列的T载体,记为pMD-18T/ CTLD1-8,并以之为模板自行设计引物进行PCR扩增MR CTLD4-7序列（1701bp）,通过TA亚克隆将CTLD4-7基因插入pMD-18T载体中构建载体pMD-18T/ CTLD4-7,转化细菌扩增质粒,酶切鉴定并测序。将pMD-18T/ CTLD4-7的CTLD4-7基因酶切并切胶回收,插入表达载体pX（pX载体的酶切位点上游连有IgG的分泌性信号肽,下游连有人IgG的Fc段）中,扩增并酶切鉴定后命名为pX/ CTLD4-7。单酶切pX/ CTLD4-7和表达载体pCDNA3.1,回收pX/ CTLD4-7的酶切产物片段Sig-CTLD4-7-Fc（2451bp）和pCDNA3.1片段,连接两者,构建的表达载体记作pCDNA3.1/Sig-CTLD 4-7-Fc,酶切鉴定,并用PCR的方法确定连入片段的方向,之后进行测序鉴定。2.培养293T细胞,脂质体法将去内毒素的pCDNA3.1/ Sig-CTLD4-7-Fc表达载体小量瞬转293T细胞,同时作阴性对照和阳性对照,分别在24h,48h,72h时收集培养上清,ELISA检测分泌蛋白的表达量,同时作细胞免疫化学进行表达的定性分析。实验结果:1.质粒转化细菌,扩增后用MluI单酶切和MluI、KpnI双酶切鉴定pMD-18T/ CTLD1-8,产生预期的3420 bp,2800 bp条带和2800bp,2120bp,1300bp条带;AatII,SalI双酶切鉴定pMD-18T/ CTLD4-7,产生预期的2200bp,1695bp,498bp条带,经测序序列正确;AatII,SalI双酶切和NotI单酶切鉴定pX/ CTLD4-7,产生预期的3621bp,1695bp和2865bp,2451bp条带;NotI单酶切鉴定pCDNA3.1/Sig-CTLD4-7-Fc产生5522 bp,2451 bp条带,PCR鉴定方向正确,测序结果正确,表明准确构建出真核表达载体。2. pCDNA3.1/ Sig-CTLD4-7-Fc表达载体瞬转293T细胞后,ELISA实验结果发现,嵌合蛋白在转然后24h时已开始分泌,分泌量在48h及72h升高;免疫细胞化学检测,确定在24h时CTLD4-7-Fc嵌合蛋白已经开始表达,而且在48h及72h持续。结论:1.重组的pcDNA3.1/Sig-CTLD4-7-Fc表达载体构建成功。2.通过脂质体法转染真核细胞293T,可在细胞中成功表达。
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