脱水素基因逆境表达模式与白桦遗传转化研究

论文摘要

水分胁迫可诱导许多基因的表达,脱水素基因（dehydrin gene,DHN）是其中之一,它属于LEA D-Ⅱ家族（late embryogenesis abundant proteins-Ⅱ）,对低温和外源ABA产生反应,或在干旱、盐以及胞外结冰的脱水胁迫植株中典型地积累,是植物遭受逆境胁迫时诱导产生的几种脱水应答蛋白质之一,脱水素富含亲水性氨基酸,具有高度亲水性,在水分亏缺下,脱水素可以作为核酸或胞质大分子的稳定剂,与膜脂结合从而阻止细胞内水分的过多流失,维持膜结构的水合保护体系,防止膜脂双分子层间距的减小,进而阻止膜融合以及生物膜结构的破坏。本文从柽柳中克隆出了具有优良抗逆能力的脱水素基因,研究了该基因在多种胁迫下的表达模式。同时,分别以白桦成熟合子胚和白桦叶片为外植体,应用农杆菌介导法,进行了白桦遗传转化研究,成功地将脱水素基因导入到白桦中,其中农杆菌介导的白桦成熟合子胚可直接诱导抗性芽形成,为白桦遗传转化研究提供了新的途径,具体研究结果如下:1.从柽柳cDNA文库中克隆得到ThDHN序列（FJ627947）,该基因全长1159bp,其中5’非编码区143 bp,3’非编码区401 bp,开放阅读框（ORF）为615 bp,编码204个氨基酸。预计该基因产物分子量为22.76kD,理论等电点为5.61。该基因序列中部有一个S片段,其后还有2个重复的K片段,属于SKn型。柽柳脱水素与已有物种的同源性在36.6%～86.7%之间,与柑桔属的脱水素蛋白（AAP56259）和咖啡的脱水素蛋白（ABC68275）的同源性最高,均为86.7%,与裸子植物欧洲赤松的脱水素蛋白（ACJ37787）的同源性最低,仅为36.6%。2.ThDHN基因可以被NaCl、ABA、冷和重金属隔（Cd）等胁迫所诱导,呈上调表达,其中,ABA诱导处理能够明显促进ThDHN基因在柽柳中的表达;而干旱胁迫则抑制了该基因在柽柳中的表达,我们推测柽柳脱水素基因依赖于ABA而表达。3.建立了白桦成熟合子胚高效不定芽诱导组培体系。白桦成熟合子胚经自来水冲洗约5-7天后,在培养基2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA培养8～9 d后即可直接诱导不定芽形成,大大缩短了不定芽诱导周期,并且该培养基的不定芽诱导率为93.3%,平均不定芽数8.7个,不定芽的生根率为100%。4.筛选出头孢霉素为白桦遗传转化体系的抑菌抗生素,使用浓度为200 mg·L-1;白桦遗传转化的选择类抗生素为卡那霉素,其使用浓度为20 mg·L-1;应用农杆菌介导的遗传转化法,白桦成熟合子胚受侵染后可直接诱导不定芽再生,获得转化植株的周期短,省去了愈伤组织诱导和愈伤组织分化出芽阶段,是白桦遗传转化研究的新途径。5.应用PCR技术、PCR-Southem杂交和Northern杂交技术对脱水素基因在白桦基因组织中的存在和表达情况进行鉴定,PCR鉴定结果表明,阳性对照和供试转基因株系均获得了615bp的目的条带,而阴性对照则没有。PCR-Southern杂交结果证实,阳性对照和转基因株系均呈阳性,而阴性对照则没有。这初步表明,柽柳脱水素基因已经整合到白桦基因组中。进一步对其进行Northern杂交,转基因株系均呈阳性,而非转基因对照呈阴性,这表明,柽柳脱水素基因已经在转录水平上表达。6.筛选0.3%NaCl(约51.28 mmol·L-1)为白桦组培苗耐盐压力值。在该盐浓度下,除转基因株系BTD7以外,所有转基因株系的主根数均多于非转基因株系,说明在同样盐胁迫条件下,盐胁迫对白桦转基因株系生长的影响小于非转基因株系,转基因白桦表现出较好的耐盐性。7.在PEG6000浓度为2.5%～7.5%的生根培养条件下,转基因株系的主根数明显多于非转基因株系,转基因白桦的抗旱性得到提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 水分胁迫对植物的伤害
• 1.2 植物抗水分胁迫的应答机制
• 1.2.1 水分胁迫下植物组织形态应答
• 1.2.2 水分胁迫下植物生理代谢应答
• 1.2.3 植物抗脱水胁迫的分子机制
• 1.3 脱水素与脱水素基因
• 1.3.1 脱水素的结构及性质特点
• 1.3.2 脱水素基因抗逆境胁迫研究
• 1.3.3 脱水素的功能与作用机理研究
• 1.3.4 脱水素诱导合成研究
• 1.3.5 脱水素转基因研究
• 1.4 我国林木遗传转化研究
• 1.5 白桦组织培养与遗传转化研究
• 1.5.1 白桦作为基因工程受体材料的重要性
• 1.5.2 白桦植株再生研究
• 1.5.3 白桦转基因研究
• 1.6 本研究的背景和意义
• 1.7 主要研究内容和技术路线
• 2 脱水素基因在多种逆境胁迫条件下的表达模式研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 ThDHN基因的克隆和生物信息学分析
• 2.1.3 柽柳总RNA提取
• 2.1.4 RNA样品定量与反转录
• 2.1.5 实时定量PCR（Real time-PCR）检测脱水素基因表达
• 2.1.6 相对定量法分析基因表达量
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 ThDHN基因的序列分析
• 2.2.2 柽柳RNA提取与反转录检测
• -1 NaCl胁迫处理下ThDHN基因在柽柳中的表达'>2.2.3 0.4mol·L^-1NaCl胁迫处理下ThDHN基因在柽柳中的表达
• 2.2.4 20%PEG干旱胁迫处理下ThDHN基因在柽柳中的表达
• 2.2.5 4℃冷胁迫处理下ThDHN基因在柽柳中的表达
• 2.2.6 重金属镉（Cd）胁迫处理下ThDHN基因在柽柳中的表达
• 2.2.7 ABA诱导处理下ThDHN基因在柽柳中的表达情况
• 2.3 讨论
• 3 白桦遗传转化中高效诱导不定芽再生体系的建立
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 种子的消毒处理方法
• 3.1.3 基本培养基筛选
• 3.1.4 不同生长调节物质对白桦成熟合子胚不定芽诱导的影响
• 3.1.5 不定芽伸长培养
• 3.1.6 不定芽生根培养
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 基本培养基的筛选
• 3.2.2 6-BA与NAA组合对白桦合子胚不定芽诱导的影响
• 3.2.3 TDZ与NAA组合对白桦合子胚不定芽诱导的影响
• 3.2.4 不定芽的伸长
• 3.2.5 不定芽的生根培养
• 3.3 讨论
• 4 白桦转基因体系的建立与遗传转化研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验试剂
• 4.1.2 ThDHN植物表达载体构建
• 4.1.3 农杆菌感受态的制备及电击转化
• 4.1.4 白桦遗传转化体系中抑菌类抗生素的筛选
• 4.1.5 白桦遗传转化体系中选择类抗生素的筛选
• 4.1.6 工程菌液的制备
• 4.1.7 农杆菌介导的白桦成熟合子胚遗传转化研究
• 4.1.8 农杆菌介导的白桦叶盘遗传转化研究
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 植物表达载体构建
• 4.2.2 不同除菌抗生素对工程菌液活性的影响
• 4.2.3 不同抑菌抗生素对白桦叶片愈伤组织诱导的影响
• 4.2.4 选择类抗生素对白桦叶片愈伤组织诱导的影响
• 4.2.5 农杆菌介导的白桦成熟合子胚遗传转化研究
• 4.2.6 农杆菌介导的白桦叶盘遗传转化研究
• 4.3 讨论
• 5 转基因白桦的分子鉴定与抗旱耐盐性研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 白桦总DNA的提取
• 5.1.2 转基因白桦的PCR鉴定
• 5.1.3 转基因白桦的PCR-Southern杂交
• 5.1.4 转基因白桦的Northern blotting鉴定
• 5.1.5 转基因白桦植株的耐盐性分析
• 5.1.6 转基因白桦植株的抗旱能力鉴定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 转基因白桦的PCR鉴定
• 5.2.2 转基因白桦的PCR-Southern杂交鉴定
• 5.2.3 转基因白桦的Northern杂交鉴定
• 5.2.4 转基因白桦耐盐性的盐试浓度测定
• 5.2.5 转基因白桦组培苗的耐盐性提高
• 5.2.6 转基因白桦的耐干旱能力提高
• 5.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢