RNA干扰抑制新城疫病毒复制的研究

论文摘要

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）属于副黏病毒科、副黏病毒亚科、禽腮腺炎病毒属,由其引发的新城疫（ND）是一种急性、高度接触性禽类传染病,被国际动物卫生组织列为A类动物传染病。ND的预防策略主要是疫苗接种,但通过加强疫苗接种的强度和密度,出现了地区散发性和非典型性等一些新的流行特点,也给ND的防控带来新的挑战。RNA干扰（RNA interference, RNAi）作为新的有效的抗病毒工具,其机制与建立在病毒蛋白基础上的传统疫苗免疫机制完全不同,是由双链RNA（double—stranded RNA,dsRNA）诱导的转录后基因特异性沉默机制,从低等原核生物,到植物、真菌、无脊椎动物,RNAi广泛存在于生物界,是生物体对抗外来基因入侵的一种保护机制。RNAi技术的发现及应用对治疗病毒感染性疾病具有重要意义,已经证明其在细胞及动物水平均能有效抑制病毒的复制和感染,如AIV、HBV、PRRSV、SARA—COV、AIV等,同时siRNA对病毒的干扰作用具有高效、特异等优点,为抗病毒研究提供新的思路。本研究利用www.ambion.com提供的在线靶位点筛选和设计工具,依据siRNA的设计原则,针对NDV复制相关的三个基因NP、P和L基因的保守区设计14个靶位点,L基因3个可能的酶的活性中心区域设计3个靶位点。经过BLAST验证,所选的序列靶序列与鸡体和其他病毒基因片段无同源性。根据pSilencer载体要求,合成17对互补的寡聚核苷酸,每条序列的设计包括5部分:siRNA正义链序列、TTCAAGAGA（Loop环）、siRNA反义链序列以及两端的BamHⅠ与HindⅢ限制性酶切位点。将各对寡聚核苷酸分别退火后,克隆到pSilencer载体,经测序鉴定正确,表明已成功构建了针对相应基因不同区域的siRNA表达质粒,为下一步进行RNAi试验奠定了基础。试验中首先验证了L基因功能区特异性的siRNA对NDV的抑制作用,将上述构建的三个L基因功能区特异性的siRNA表达质粒分别转染到CEF细胞,同时设空载体和非转染组为对照,转染后8h接种NDV,通过间接免疫荧光、病毒滴度的测定和Real-time PCR检测siRNAs在细胞水平对NDV抑制作用。Real-time PCR方法检测到转染psi-L6、psi-L7和psi-L9的CEF细胞中L基因的转录水平分别降低79.1%、91.3%和93.9%,P基因的转录水平分别降低73%、86.3%和89.8%;细胞培养上清中病毒的滴度（TCID50）分别降低2.19、3.16和5.24倍;间接免疫荧光实验证明了Psi-L6、Psi-L7和Psi-L9了抑制NDV抗原蛋白的表达。表明这3个靶点是L蛋白的重要功能区。L基因保守区特异性的siRNA对NDV的抑制作用检测结果证明:转染Psi-L2、Psi-L3、Psi-L4和Psi-L5的细胞中L基因的转录水平分别降低45.5%、79.3%、61.2%和62.8%,P基因的转录水平分别降低49.0%、83.3%、63.1%和76.1%;病毒的滴度（TCID50）分别降低:1.12、4.85、2.04和3.24倍;间接免疫荧光分析siRNA处理的细胞中NDV抗原蛋白的表达明显减少。在转染P基因特异性的siRNA（Psi-P1、Psi-P2、Psi-P3、Psi-P4和Psi-P5）的CEF细胞中NDV抗原蛋白的表达均有不同程度的降低,病毒效价测定结果表明siRNA表达质粒处理的细胞培养上清中病毒的滴度与对照相比分别降低了1.6、2.1、3.46、6.76、2.81倍;Real-time PCR检测到P基因的转录水平分别降低38.2%、52.5%、68.1%、82.9%和37.3%,L基因的的转录水平分别降低44%、62.6%、72.4%、76.6%和67.9%。为了验证N特异性的siRNA对NDV的抑制作用,将上述构建的5个靶向N基因的siRNA表达质粒转染到CEF细胞,接毒后间接免疫荧光试验发现Psi-N2处理的细胞NDV抗原蛋白的表达明显减少;Real-time PCR检测到Psi-N2处理的细胞L基因的mRNA比对照相比减少了79.3%,病毒滴度减少了3.5倍。选择Psi-L7、Psi-L3和Psi-N2三个对NDV抑制作用比较好三个靶位点,根据Invitrogen公司提供的miRNA设计原则,设计合成了三对含有miRNA序列的寡聚核苷酸,克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体,并在此基础上构建了miRNA串联表达质粒P-N2-L7-L3。在鸡胚上评价了miRNA串联表达质粒P-N2-L7-L3对NDV的抑制效应,Real-time PCR检测到P-N2、P-L3和P-L7处理的鸡胚中病毒的转录水平与对照相比分别降低了68.9%、76.3%和74.2%,P-N2-L7-L3组降低了92.9%;血凝价测定表明P-N2-L7-L3比单一表达miRNA的质粒能更有效的抑制新城疫病毒在鸡胚中增殖,在感染后24h和36h抑制病毒的增值率分别为79.2%和89.6%,P-L7、P-N2和P-L3在24h和36h对病毒的增殖的抑制作用分别为70.8%、66.7%、58.3%和79.2%、75%、70.8%。表明串联表达的miRNA对能协同抑制NDV的复制。本研究筛选出了有效抑制NDV增殖的RNAi靶点,为进一步通过转基因技术在动物水平RNAi抗NDV研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1. 新城疫病毒研究进展
• 1.1 新城疫概述
• 1.2 新城疫病毒分子生物学特点
• 1.3 NDV 的复制
• 1.4 NDV 的防治
• 2 RNAI 及其抗病毒研究进展
• 2.1 RNAi 现象的发现
• 2.2 RNAi 的分子机制
• 2.3 miRNA
• 2.3 哺乳动物特殊的RNAi 现象
• 2.4 RNAi 的优点
• 2.5 siRNA 的制备
• 2.6 RNAi 抗病毒作用
• 2.7 RNAi 的局限性
• 2.8 结论
• 3 本研究的目的和意义
• 实验一：载体表达SHRNA 抑制新城疫病毒复制
• 1 材料
• 1.1 病毒、载体、菌株和SPF 鸡胚
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 shRNA 设计与表达载体的构建
• 2.2 CEF 细胞的制备和培养
• 2.3 转染
• 2.4 病毒接种
• 2.5 Real-time PCR
• 2.7 间接免疫荧光
• 3 结果
• 3.1 RNAi 靶位点的选择和表达载体的构建
• 3.2 Real－time PCR 标准曲线的建立
• 3.3 L 基因（功能区）特异性的shRNA 对NDV 的抑制作用
• 3.4 L 基因保守区特异性的shRNA 对NDV 的抑制作用
• 3.5 P 基因特异性的shRNA 对NDV 的抑制作用
• 3.6 NP 基因特异性的shRNA 对NDV 的抑制作用
• 4 讨论
• 实验二：MIRNA 表达载体的构建及其在鸡胚中对NDV 的抑制作用
• 1 材料
• 1.1 病毒、载体、菌株和SPF 鸡胚
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 miRNA 设计与表达载体的构建
• 2.2 鸡胚的转染
• 2.3 miRNA 对NDV 抑制作用的检测
• 3 结果
• 3.1 miRNA 的设计、合成
• 3.2 重组质粒的酶切鉴定
• 3.3 重组质粒的测序鉴定
• 3.4 miRNA 对NDV 抑制作用的检测
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介