外源bar+nas双价基因转化多年生黑麦草的研究

论文摘要

多年生黑麦草（Lolium perenne L.）不仅是一种优质牧草,更是一种常用的观赏型和运动型草坪草种。针对草坪杂草难以防除和冷季型草坪草抗旱性差、绿色期短的不足,该研究以多年生黑麦草常用品种爱神特、卡特等为材料,建立并优化了多年生黑麦草高频离体培养再生体系、农杆菌转化技术体系和拟转化子的筛选方案,通过农杆菌介导法将外源双价抗除草剂基因——草丁膦抗性基因（bar）和抗旱基因——烟碱酰胺合成酶基因（nas）导入多年生黑麦草中,得到了具有抗除草剂和抗旱两种抗性的多年生黑麦草转基因植株。主要研究结果如下:1.建立并优化了多年生黑麦草胚性愈伤组织诱导与分化的培养条件研究结果表明,含胚的半粒种子是诱导愈伤组织较为理想的外植体,其平均愈伤组织诱导率可达86%,其愈伤组织分化率可达85%;MS培养基是绝大多数多年生黑麦草愈伤组织的最适诱导与继代培养基;随着2,4-D浓度的增加,愈伤组织诱导率上升,8.0 mg/L较为适合;为避免高浓度2,4-D对愈伤组织生长及再分化的伤害,愈伤组织继代培养时可适当降低2,4-D浓度;继代培养基中添加25g/L的甘露醇可以有效地改善愈伤组织的生长状态,促进胚性愈伤组织的形成;MS培养基上诱导的丛生不定芽较粗壮,NB培养基上诱导的丛生不定芽较细密。具体操作方式为:胚端半粒种子于MS+2,4-D 8.0 mg/L（或另添加甘露醇25g/L）上诱导愈伤组织;愈伤组织接种于MS+2,4-D 4.0mg/L+甘露醇25 g/L上进行1-2次继代后于NB+6-BA2.0 mg/L上进行分化;不定芽转接至MS+6-BA2.0 mg/L上进行扩繁或于1/2MS+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/L上进行生根。2.将外源bar+nas双价基因导入多年生黑麦草中获得了转基因植株构建了bar+nas双价基因植物表达载体（EHA105—p3301-gus-nas,LBA4404—p3301-gus-nas）,并进行了nas基因的原核表达和多克隆抗体制备,为多年生黑麦草的转化和检测提供了材料。优化了多年生黑麦草愈伤组织农杆菌转化方法。实验结果表明,根癌农杆菌EHAl05菌株对多年生黑麦草的转化效果优于LBA 4404菌株的转化效果;在转化之前一直将受体愈伤组织在含甘露醇的培养基上继代培养可提高受体材料的质量;在共培养过程中采用浸泡共培养基的滤纸代替固体共培养基,既能增强抑菌效果,又可维持愈伤组织状态,提高转化频率,还可简化操作程序。选用Basta作为筛选剂对多年生黑麦草抗性愈伤组织和抗性植株进行筛选,其适宜的筛选浓度为7.5-10mg/L,其筛选时间以40-60天为宜。获得了转基因多年生黑麦草植株。应用本研究所建立的农杆菌转化系统,将bar基因和nas基因导入多年生黑麦草愈伤组织,经筛选剂筛选获得20株抗性植株。通过对部分植株进行PCR,RT-PCR和Western blot杂交等分子检测的结果表明,外源目的基因已整合进了多年生黑麦草转化植株基因组。3.进行了除草剂抗性和抗旱性鉴定经叶面喷施除草剂溶液,转基因植株具有不同程度的抗性,抗性最高可达150-200mg/L Basta。通过反复干旱法,发现转基因植株抗旱性得到增强,整体观感较好;而未转化株经过长期的反复干旱,失水严重,最后死亡。在自然干旱条件下,对转基因植株和未转化株生理生化指标进行了测定,结果表明:转化株土壤保水能力、植株增长速度、根生长速度、叶片相对水含量、叶绿素含量均高于未转化株;丙二醛含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、叶片水势和叶片外渗溶液相对电导率的变化规律表明转基因植株与未转化株相比,抗旱性得到增强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 草坪草遗传转化研究进展
• 1.1 草坪草离体培养再生体系的建立
• 1.2 草坪草遗传转化研究进展
• 2 植物抗旱相关基因及其应用
• 2.1 植物中的抗旱相关的功能基因及其应用
• 2.1.1 渗透调节物质合成及调节相关基因及其应用
• 2.1.1.1 与脯氨酸（Proline）合成有关的酶基因
• 2.1.1.2 与甜菜碱合成有关的酶基因
• 2.1.1.3 与甘氨酰甜菜碱（Glycine betaine）合成有关的基因
• 2.1.1.4 与海藻糖（Trehalose）合成有关的酶基因
• 2.1.1.5 与果聚糖（Fructant）合成相关的酶基因
• 2.1.1.6 糖醇合成的相关基因
• 2.1.1.7 肌醇甲酯（D-ononitol）生物合成相关基因
• 2.1.1.8 多胺（Polyamine）合成相关基因
• 2.1.1.9 调控水通道蛋白基因
• 2.1.2 活性氧清除相关基因及其应用
• 2.1.2.1 SOD基因
• 2.1.2.2 CAT基因
• 2.1.2.3 POD基因
• 2.1.3 保护生物大分子及膜结构的蛋白基因及其应用
• 2.1.3.1 胚胎发生后期富集蛋白基因（Lea）及Lea相关基因
• 2.1.3.2 调渗蛋白基因
• 2.1.3.3 脱水蛋白基因
• 2.2 植物中的抗旱相关的调节基因及其应用
• 2.2.1 与信号传导相关的基因
• 2.2.2 编码转录因子的调节基因
• 2.3 展望
• 3 草坪草对干旱胁迫的反应
• 3.1 草坪草避旱性
• 3.1.1 根系形态和根系活力
• 3.1.2 气孔开闭与水分蒸腾
• 3.2 草坪草耐旱性
• 3.2.1 叶片的适应性
• 3.2.2 细胞壁的变化
• 3.2.3 膜透性的变化
• 3.2.4 渗透调节
• 3.2.5 脯氨酸含量的变化
• 3.2.6 抗氧化酶活性的变化
• 4 本论文研究目的和意义
• 5 本研究的技术路线
• 第二章 多年生黑麦草高频再生体系的建立及优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 外植体
• 1.2.2 外植体的消毒预处理
• 1.2.3 培养基及培养条件
• 1.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 不同外植体处理方式对愈伤组织诱导的影响
• 2.2 2.4-D浓度对不同品种愈伤组织诱导率的影响
• 2.3 外植体在不同基本培养基上诱导愈伤组织的情况
• 2.4 不同基本培养基对愈伤组织分化不定芽的影响
• 2.5 生根和移栽
• 3 讨论
• 3.1 外植体的选择及预处理
• 3.2 培养基成分对愈伤组织诱导的影响
• 3.3 愈伤组织分化不定芽
• 第三章 Bar+nas双价基因转化多年生黑麦草
• 1 试验材料
• 1.1 黑麦草品种
• 1.2 菌株、质粒与基因
• 1.3 试剂
• 2 试验方法
• 2.1 p3301-gus-nas植物表达载体的构建
• 2.1.1 pCAMBIA 3301-gus的构建
• 2.1.1.1 pCAMBIA 3301和pBI121质粒提取
• 2.1.1.2 用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ分别双酶切pCAMBIA 3301和pBI121
• 2.1.1.3 酶切片段回收
• 2.1.1.4 回收片段连接
• 2.1.1.5 重组质粒转化DH5α
• 2.1.1.6 重组质粒检测
• 2.1.2 p3301-gus-nas载体的构建
• 2.1.2.1 p3301-gus和p0390-MF-nashor1质粒提取
• 2.1.2.2 BamH Ⅰ酶切p0390-MF-nashor1和pCAMBIA 3301-gus
• 2.1.2.3 酶切片段的回收
• 2.1.2.4 pCAMBIA 3301-gus酶切回收产物去磷酸化
• 2.1.2.5 去磷酸化片段的回收
• 2.1.2.6 目的基因nas与表达载体pCAMBIA 3301-gus的连接
• 2.1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.2.8 连接产物转化DH5α
• 2.1.2.9 拟转化子的鉴定
• 2.1.3 p3301-gus-nas转化农杆菌
• 2.1.3.1 p3301-gus-nas质粒的提取
• 2.1.3.2 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.3.3 p3301-gus-nas转化农杆菌
• 2.1.3.4 检测
• 2.2 Nas基因原核表达及多克隆抗体制备
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 NAS蛋白编码基因的扩增
• 2.2.3 重组表达载体的构建及其鉴定
• 2.2.4 重组蛋白GST-NAS的诱导表达
• 2.2.5 GST-NAS蛋白包涵体的纯化与抗体制备
• 2.2.6 Western blotting检测
• 2.2.7 其他方法
• 2.3 外植体培养
• 2.3.1 培养基
• 2.3.2 培养方法
• 2.4 农杆菌转化
• 2.4.1 农杆菌转化用培养基
• 2.4.2 农杆菌对愈伤组织的转化
• 2.5 转化子的筛选
• 2.5.1 筛选剂抑制效果的测定
• 2.5.2 转化子的筛选与再生培养
• 2.6 转化植株的分子检测
• 2.6.1 植物总DNA的提取
• 2.6.1.1 试剂配制
• 2.6.1.2 植物总DNA的微量提取（用于PCR）
• 2.6.2 转化植株的PCR分析
• 2.6.2.1 Bar基因的PCR分析
• 2.6.2.2 Nas基因的PCR分析
• 2.6.2.3 RT-PCR检测
• 2.6.3 蛋白质的免疫检测（Western blot）
• 2.6.3.1 植物总可溶性蛋白的提取
• 2.6.3.2 蛋白质的电转移
• 2.6.3.3 封闭、杂交及显色
• 3 结果与分析
• 3.1 p3301-gus-nas植物表达载体的构建
• 3.1.1 pCAMBIA 3301-gus的构建
• 3.1.2 p3301-gus-nas载体的构建
• 3.1.3 p3301-gus-nas转化根癌农杆菌
• 3.2 Nas基因原核表达和多克隆抗体制备
• 3.2.1 NAS蛋白编码基因亚克隆
• 3.2.2 原核重组表达质粒pKG-NAS的鉴定
• 3.2.3 NAS蛋白的原核表达
• 3.2.4 NAS多克隆抗体的制备及效价检测
• 3.3 愈伤组织筛选条件的确定
• 3.4 转化方法的改进
• 3.4.1 共培养方式的改进
• 3.4.2 多年生黑麦草农杆菌转化体系的建立
• 3.5 转化植株的获得
• 3.6 拟转化株的检测
• 3.6.1 PCR检测结果
• 3.6.1.1 Bar基因的PCR分析
• 3.6.1.2 Nas基因的PCR分析
• 3.6.2 Nas基因在转基因植株中的转录和表达
• 4 讨论
• 4.1 影响农杆菌转化多年生黑麦草的主要因素
• 4.1.1 受体系统的再生能力
• 4.1.2 受体细胞的状态
• 4.1.3 农杆菌菌株的选择和表达载体的构建
• 4.1.4 Vir基因活化物的添加
• 4.1.5 合适的筛选方式
• 4.2 转基因多年生黑麦草的生物安全性问题
• 第四章 转基因植株抗性鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 转基因植株除草剂抗性检测
• 1.2.2 转基因植株抗旱性检测
• 1.2.2.1 干旱处理
• 1.2.2.2 土壤含水量测定
• 1.2.2.3 叶片相对含水量（RWC）测定
• 1.2.2.4 叶绿素含量的测定
• 1.2.2.5 脯氨酸含量的测定
• 1.2.2.6 丙二醛（MDA）含量测定
• 1.2.2.7 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
• 1.2.2.8 过氧化物酶（POD）活性测定
• 1.2.2.9 过氧化氢酶（CAT）活性测定
• 1.2.2.10 植物细胞膜通透性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 除草剂抗性鉴定
• 2.2 转化株与对照株整体抗旱性评价
• 2.3 干旱处理过程中土壤含水量的变化
• 2.4 植株高度和根系生长状况
• 2.5 转化株与对照株叶片相对含水量变化
• 2.6 转化株与对照株叶绿素含量变化
• 2.7 转化株与对照株叶片丙二醛含量变化
• 2.8 转化株与对照株叶片脯氨酸含量变化
• 2.9 转化株与对照株SOD、POD、CAT活性变化
• 2.10 转化株与对照株质膜透性变化
• 3 讨论
• 3.1 草坪草抗旱性的研究方法
• 3.2 多年生黑麦草生理生化指标的变化与抗旱性的关系
• 3.3 我国草坪草抗旱研究存在的问题与发展方向
• 本研究的总结及创新点
• I 总结
• II 本研究的创新点
• 参考文献
• 附录A:质粒结构图
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间科研学术成果目录