1、NEDD9在肝癌侵袭转移中的作用研究 2、肝癌单链抗体的可溶性表达及活性鉴定

论文摘要

肝癌是我国常见的一种恶性肿瘤,其恶性程度高,容易发生复发转移。大部分肝癌患者都是死于肿瘤的复发和转移,然而对于肝癌复发转移目前治疗手段有限。这就迫使科研工作者和临床医师不断努力寻找肝癌侵袭转移相关的基因改变,以期阐明肝癌复发和转移的机制,试图从根本上攻克肝癌的复发和转移。研究目的:检测肝癌标本及肝癌细胞系中NEDD9的表达情况,分析其表达与肝癌侵袭转移的关系,利用RNA干扰技术下调肝癌细胞系中NEDD9的表达,降低NEDD9的表达后观察肝癌细胞体外迁移、侵袭能力及增殖能力的变化。研究方法:1、收集有及无转移发生的肝癌标本,利用免疫组织化学的方法检测肝癌标本中NEDD9的表达。2、提取细胞总RNA利用RT-PCR的方法检测肝癌细胞系及永生化的正常肝细胞中NEDD9的表达情况。3、选择干扰靶点,设计合成寡核苷酸链,体外退火后将其克隆入干扰表达载体pSilencer3.1中,构建针对NEDD9特异性的shRNA表达载体,利用构建的载体转染肝癌细胞系MHCC97,通过RT-PCR、Western-blot及间接免疫荧光分别检测NEDD9在mRNA水平和蛋白水平的变化。4、下调肝癌细胞系中NEDD9的表达后,利用划痕实验及体外侵袭实验检测肝癌细胞体外迁移能力和侵袭能力的变化。5、通过MTT检测下调NEDD9的表达对肝癌细胞增殖能力的影响。6、利用流式细胞仪检测下调NEDD9的表达对肝癌细胞周期的影响。实验结果:1、免疫组织化学结果显示NEDD9在大部分肝癌组织中均有表达,在有转移的肝癌组织中NEDD9的表达量及阳性率均较无转移的肝癌组织高。2、NEDD9在肝癌细胞系中表达增高。我们利用RT-PCR的方法检测了三种肝癌细胞系MHCC97、HepG2、Huh7及永生化的正常肝细胞QZG中NEDD9的表达,结果显示与正常肝细胞相比,三种肝癌细胞系中均有NEDD9的高表达,高转移肝癌细胞系MHCC97中表达量较高。3、成功构建了针对NEDD9的shRNA表达载体。将所构建的shRNA表达载体转染肝癌细胞系MHCC97,发现其能明显降低肝癌细胞中NEDD9的表达,无论是在mRNA水平还是在蛋白水平。4、减低肝癌细胞系MHCC97中NEDD9的表达可以抑制肝癌细胞体外迁移和侵袭的能力。针对NEDD9的shRNA转染会导致MHCC97细胞体外迁移能力的降低及侵袭能力下降。5、降低肝癌细胞系MHCC97中NEDD9的表达可以抑制肝癌细胞的增殖及出现细胞周期的S期阻滞。MHCC97细胞转染NEDD9特异性的shRNA后,通过MTT检测发现肝癌细胞的增殖能力受到了明显的抑制;利用流式细胞仪检测发现处于细胞周期S期的细胞数减少,出现了S期阻滞。结论:本研究提示NEDD9在有转移的肝癌标本中及高转移的肝癌细胞系中高表达,通过体外实验表明其在肝癌的迁移和侵袭转移中发挥着重要作用,是一个与肝癌侵袭转移相关的分子,有望成为一个抗肝癌侵袭和转移的治疗靶点或肝癌侵袭转移的预测指标。肿瘤特异性单链抗体在肿瘤的诊断和治疗中有着良好的应用前景。我们实验室利用噬菌体抗体库技术,构建了全人源肝癌单链抗体噬菌体库,从中筛选到了一株肝癌特异性单链抗体,并在体外进行了原核表达,但是表达出的单链抗体主要是以包涵体形式存在,需要经过复杂的复性过程才能够得到有活性的目的蛋白。实验目的:构建肝癌单链抗体的可溶性原核表达系统,并鉴定其生物学活性,为其下一步应用研究打下基础。实验方法:将所筛选出来的单链抗体基因克隆入原核表达载体pET-32a中,利用pET-32a表达出来的硫氧环蛋白增加目的蛋白的可溶性。将所构建的重组载体克隆入大肠杆菌BL21表达菌中。利用IPTG诱导表达,表达后通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。表达产物经Ni-NTA纯化后,利用细胞ELISA和间接免疫荧光等分析其活性。实验结果:经酶切鉴定,证实目的基因scFv-D25正确克隆入pET-32a中,成功构建了原核表达载体pET-32a/scFv-D25。在大肠杆菌BL21中实现了scFv-D25的可溶性表达。经Ni-NTA纯化后得到了高纯度的纯化产物。通过细胞ELISA及间接免疫荧光分析证实所得的scFv-D25具有与肝癌结合的特异性。结论:成功构建了肝癌单链抗体的pET-32a表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,表达产物主要以可溶性形式存在。经Ni-NTA纯化并得到了高纯度的纯化产物,所得到的纯化产物具有与肝癌细胞特异性结合的功能。为单链抗体scFv-D25在肝癌诊断和治疗中的应用奠定了基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一、肝癌中NEDD9 表达的检测及NEDD9 特异性SHRNA 表达载体的构建
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二、抑制NEDD9 表达对肝癌细胞迁移、侵袭及生长的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三、肝癌单链抗体的可溶性表达及活性鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢