皱纹盘鲍和栉孔扇贝抗菌肽的研究

论文摘要

皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）和栉孔扇贝（Chlamys farreri）是我国黄渤海区的重要自然资源,也是我国北方的重要养殖品种。九十年代中期以来,病害频繁发生,造成的经济损失达百亿元,直接威胁到现有产业的生存。为了促进我国贝类养殖业的复兴和健康发展,实现我国蓝色农业的可持续化,海水养殖动物的免疫抗病机制成为最突出和亟待解决的问题。抗菌肽（antibacterial peptide）是基因编码的肽类抗菌分子,它们广泛存在于生物体内,是脊椎动物、无脊椎动物和植物的先天性免疫关键因子。长期以来,国内外对抗菌肽的研究主要集中在高等动物和一些低等昆虫方面,海洋抗菌肽研究是10年来发展起来的一个热点。本论文以我国重要海水养殖动物——栉孔扇贝和皱纹盘鲍为研究对象,开展抗菌肽的研究,取得了以下结果:（1）本文利用固相提取和HPLC技术,结合灵敏的酶标抗微生物活性检测法,从栉孔扇贝血液中纯化出1种抗菌肽。经测定其分子量为2000Da,部分氨基酸序列为GQPGHTGNAH……。（2）从作者所在实验室构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中,筛选得到了鲍防御素基因EST。通过序列分析,发现该基因cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成。该前体的成熟肽含42个氨基酸,推测分子量为4323Da、等电点为8.02。氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性最高、达到了70%。因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,作者认为该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,并将其命名为鲍防御素（hd-def）。（3）用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达,且鳗弧菌刺激引起的表达量比金黄色葡萄球菌诱导的高,说明该防御素基因属于诱导型表达。在被检测的5种组织中,hd-def基因仅在肝胰腺中表达,而在其它组织（性腺、鳃、肌肉和外套膜）中均未检测到表达。说明该基因具有明显的组织表达特异。人工感染刺激后,不同时间皱纹盘鲍的hd-def表达量有很大差异。感染早期（2hr）表达非常微弱,4hr时表达量明显增大,感染中晚期（12hr）表达量最大。该结果提示,hd-def基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染。（4）采用基因组步移法,获得了4032bp的全长基因组序列。分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497、2357和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中,这种是一种防御素基因的新结构模式,在其他昆虫防御素均未报道。（5）本文利用酵母表达系统,成功构建鲍hd-def基因的重组表达载体pPIC9k-hddef。重组酵母体外表达4.3kd蛋白,具有抗鳗弧菌和金黄色葡萄球菌的活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第一节 抗菌肽的研究进展
• 1.1 抗菌肽的基本特性
• 1.2 抗菌肽的种类和结构
• 1.3 抗菌肽生物学效应及机制研究
• 1.3.1 对微生物等的直接杀灭或抑制作用
• 1.3.2 抗菌肽的免疫防御作用
• 1.4 抗菌肽基因的表达与调控
• 1.4.1 基因定位
• 1.4.2 基因调控与机制
• 1.5 抗菌肽的开发与应用前景
• 1.5.1 药物开发
• 1.5.2 转基因生物和抗病品种培育
• 1.5.3 保鲜剂和饲料添加剂
• 第二节 海洋抗菌肽研究进展
• 2.1 海洋抗菌肽的种类与结构
• 2.2 海洋抗菌肽的功能
• 2.3 海洋抗菌肽的基因克隆
• 2.4 抗菌肽的免疫防御与基因表达
• 2.5 海洋抗菌肽的重组表达
• 第三节 毕赤酵母体外重组表达系统
• 3.1 巴斯德毕赤酵母细胞的基本特性
• 3.2 影响外源蛋白表达的因素
• 3.3 毕赤酵母表达系统的应用与展望
• 第四节 研究目的、意义和内容
• 4.1 鲍和扇贝的养殖现状与存在问题
• 4.1.1 鲍
• 4.1.2 扇贝
• 4.2 研究意义和内容
• 第二章 栉孔扇贝抗菌肽分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 样品采集
• 1.2 酸性提取
• 1.3 固相提取（SPE）
• 1.4 HPLC 纯化
• 1.5 微生物检测
• 1.6 测序
• 2 结果
• 2.1 诱导与粗提
• 2.2 稻瘟真菌模型实验
• 2.3 抗菌肽纯化
• 2.4 序列测定
• 3 讨论
• 第三章 皱纹盘鲍防御素和基因表达
• 第一节 皱纹盘鲍防御素及cDNA 序列分析
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第二节 皱纹盘鲍防御素基因表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验动物和试剂
• 2.1.2 总RNA 的提取
• 2.1.3 cDNA 合成
• 2.1.4 半定量rt－PCR 扩增
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第四章 皱纹盘鲍防御素（hd-def）的基因组克隆与结构分析..
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物与试剂
• 1.2 基因组DNA 提取
• 1.3 hd-def 编码区基因组克隆
• 1.4 侧翼序列的基因组克隆
• 1.5 PCR 扩增产物回收、转化、测序
• 1.6 鲍防御素基因组结构分析
• 2 结果
• 2.1.h d-def 的基因组克隆
• 2.2 鲍防御素基因组结构
• 3 讨论
• 第五章 皱纹盘鲍防御素重组表达
• 1 材料和方法
• 1.1 表达载体和培养基
• 1.2 目的基因的获得
• 1.3 过渡载体pPIC 9-hddef 的构建
• 1.3.1 碱裂解法大量提取质粒pPIC9
• 1.3.2 质粒pPIC9 的双酶切
• 1.3.3 连接反应和转化
• 1.4 表达载体pPIC9k-hddef 的构建
• 1.5 毕赤酵母电转化和阳性转化子筛选
• 1.5.1 重组表达质粒pPIc9k-hddef 的线性化
• 1.5.2 重组表达质粒脱磷酸化处理
• 1.5.3 感受态酵母制备
• 1.5.4 电击转化
• 1.5.5 毕赤酵母基因组提取和PCR 鉴定重组子
• 1.6 重组酵母的诱导表达
• 1.7 酵母表达外源蛋白质的SDS-PAGE
• 1.8 重组表达产物的活性检测
• 2 结果
• 2.1 表达载体的构建
• 2.2 转化与诱导表达
• 2.3 生物学活性
• 3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 个人简历
• 博士论文期间发表和完成论文
• 致谢