重组克痛宁在巴斯德毕赤酵母中的表达

论文摘要

克痛宁（α-Cobratoxin）是一种来源于眼镜王蛇毒腺的神经毒素,含72个氨基酸残基,空间结构为三指环形,具有与神经肌肉接头的N-型乙酰胆碱受体（nAChR）结合的活性;常用来作为研究AChR结构、功能及其相互关系,以及研究神经传导和离子通道等的工具。同时克痛宁也具有较高的医用价值,如治疗重症肌无力,并且有良好的镇痛、戒毒和抑瘤作用等。但由于眼镜王蛇属于国家二级保护动物,采用杀蛇取毒的方法药源受到限制,不能满足市场需求,因此我们采用基因工程的方法来生产克痛宁。 本研究选用了巴斯德毕赤酵母作为基因表达系统,受体菌为GS115菌株,分泌型质粒pPIC9为载体,构建重组质粒pPIC9k/HIP,线性化后,电击法转化巴斯德毕赤酵母,筛选出his+Muts表型阳性克隆菌株GS115-CBT 18株。在此基础上,进一步利用重组菌对G418抗性的差异筛选出了具有不同外源基因拷贝数的菌株,并成功表达了克痛宁前体。小试样品经分离纯化后获得了少量克痛宁前体样品,肠激酶酶切后用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳进行分子量分析,结果表明所设计的克痛宁基因在毕赤酵母中获得了正确的表达。 为了适应工业化生产,本文还对菌种生长及诱导表达条件进行了探索优化。针对发酵过程中对产量影响较大的因素进行了正交实验分析,得出了最佳培养条件:pH值6.0,微量元素为7.5mL/L,硫酸铵浓

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 克痛宁（蛇神经毒素）简介
• 1.1.1 蛇神经毒素的分类
• 1.1.2 蛇神经毒素的分子结构
• 1.1.3 蛇神经毒素的受体
• 1.1.4 蛇神经毒素作用的分子机制
• 1.1.5 蛇神经毒素在理论研究中的应用
• 1.1.6 蛇神经毒素的临床应用
• 1.1.7 研究现状及发展趋势
• 1.1.8 蛇毒α-神经毒素及其基因研究进展
• 1.1.8.1 α-NT蛋白质结构
• 1.1.8.2 α-NT的cDNA
• 1.1.8.3 α-NT的基因组DNA
• 1.1.8.4 α-NT的人工合成与表达
• 1.2 酵母表达系统
• 1.2.1 异源蛋白在酵母菌中表达的一般步骤
• 1.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
• 1.2.2.1 巴斯德毕赤酵母表达系统简介
• 1.2.2.2 表达载体的发展
• 1.2.2.3 受体菌的发展
• 1.2.2.4 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中高效表达的策略
• 1.2.2.5 总结和展望
• 1.3 论文的新颖性
• 第二章 克痛宁（CBT）重组菌株的构建及筛选
• 2.1 设计思路及研究方案
• 2.1.1 基因序列的设计
• 2.1.2 研究方案
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 菌种和质粒
• 2.2.1.2 其它材料
• 2.2.1.3 仪器设备
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 pPIC9K／Bi质粒的提取
• 2.2.2.2 pPIC9K／Bi质粒线性化
• 2.2.2.3 pPIC9K／Bi质粒浓度与纯度的测定
• 2.2.2.4 pPIC9K／Bi质粒的检验
• 2.2.2.5 制备GS115感受态
• 2.2.2.6 电转化
• +Mut^s阳性克隆'>2.2.2.7 筛选his⁺Mut^s阳性克隆
• 2.2.2.8 G418筛选高拷贝转化子
• 2.2.3 结果与讨论
• 2.2.3.1 提取pPIC9K／Bi质粒浓度与纯度测定
• 2.2.3.2 对pPIC9K／Bi质粒进行DNA测序
• 2.2.3.3 电转化及其条件的优化
• +Mut^s转化子与高拷贝转化子的筛选'>2.2.3.4 His⁺Mut^s转化子与高拷贝转化子的筛选
• 第三章 目标蛋白的诱导表达与分析
• 3.1 研究目的
• 3.2 试验材料
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 仪器设备
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 克痛宁（CBT）在高拷贝数菌株中的诱导表达
• 3.3.2 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.3.2.1 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳缓冲液体系
• 3.3.2.2 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳垂直板凝胶的制备
• 3.3.2.3 蛋白样品的制备
• 3.3.2.4 蛋白样品的凝胶电泳
• 3.3.2.5 电泳后凝胶的固定及染色
• 3.4 结果与讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 发酵培养条件的优化
• 4.1 研究目的
• 4.2 试验材料
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 仪器设备
• 4.3 试验操作及方法
• 4.3.1 基础盐培养基发酵
• 600值关系的测定'>4.3.2 细胞干湿重与OD₆₀₀值关系的测定
• 4.3.3 发酵液中中甘油浓度的测定
• 4.3.3.1测定原理
• 4.3.3.2 测定方法
• 4.3.4 发酵液中总蛋白浓度的测定
• 4.3.4.1 原理
• 4.3.4.2 各种母液的配制
• 4.3.4.3 标准曲线的测定
• 4.3.4.4 发酵液样品蛋白浓度的测定
• 4.3.5 发酵条件的优化
• 4.3.6 克痛宁（CBT）的小试发酵
• 4.4 结果与讨论
• 600值的关系'>4.4.1 细胞干湿重与OD₆₀₀值的关系
• 4.4.2 发酵条件的优化
• 4.4.2.1诱导期pH值的优化
• 4.4.2.2 溶氧条件的优化
• 4.4.2.3 补加油酸策略的优化
• 4.4.2.4培养基组分的优化
• 4.4.3 克痛宁的小试放大
• 4.5 本章小结
• 第五章 克痛宁的初步分离纯化及活性鉴定
• 5.1 研究目的
• 5.2 材料与仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 样品预处理
• 5.3.2 去除杂蛋白
• 5.3.3 离子交换吸附
• 5.5 活性鉴定
• 5.5.1 目标蛋白前体的酶切
• 5.5.2 动物实验验证
• 5.6 本章小结
• 第六章 结论
• 第七章 问题与建议
• 参考文献
• 附录一 培养基
• 附录二 缓冲液
• 附录三：离子交换柱特征表
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文