论文摘要
鸡传染性喉气管炎（ILT）是由鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起鸡的一种急性、高度接触性上呼吸道传染病,呈全球性流行,是危害养禽业的重要疫病之一。目前国内外防制本病普遍采用弱毒疫苗。这些疫苗的毒力普遍偏强,可以在鸡体内潜伏感染,而且在鸡体传代过程中毒力返强。因此,研制更安全而有效的疫苗,将有利于彻底控制乃至根除ILT。DNA疫苗作为第3代疫苗,因其既有亚单位疫苗的安全性,又有减毒活疫苗的有效性而受到研究人员的瞩目。但是DNA疫苗诱导机体产生的抗体水平低,还不能完全有效抵抗致死剂量病原体的攻击,因此,本研究采用PCR技术从河南省分离的ILTV HN1株DNA中扩增gB基因,构建gB基因重组真核表达质粒,并将其与鸡IL-18基因重组真核表达质粒联合免疫SPF鸡,探索ILTV HN1株gB基因的免疫原性以及鸡IL-18的免疫增强作用,以期为更好地防制ILT提供新的思路。研究内容如下：1.根据已发表的ILTV SA2疫苗株gB基因序列（M64927）设计、合成了1对引物,以ILTV HN1株基因组DNA为模板,从河南省分离的ILTV HN1株DNA中扩增gB基因,并进行克隆和测序。结果表明,获得了ILTV HN1株gB基因,全长为2629bp,包含一个完整的开放阅读框,共编码873个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有8个潜在的N-糖基化位点,有12个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,ILTV HN1株gB基因与GenBank中读取的澳大利亚SA2疫苗株、辽宁疫苗株、烟台株、美国632强毒株、英国Throne强毒株gB基因核苷酸序列同源性为99%以上,与ILTV-SA2株gB基因比较发现,ILTV HN1株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1个碱基G,而在第102位又都插入1个碱基A,从而引起该毒株gB基因推导的氨基酸序列中第28-32位5个氨基酸的移码突变。2.根据真核表达载体pcDNA3.1（+）和ILTV gB全基因核苷酸序列,设计、合成1对引物,PCR扩增ILTV gB全基因。将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切获得的gB基因片段克隆到经同样处理的真核表达载体pcDNA3.1（+）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB（简称pgB）。将pgB质粒转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,RT-PCR表明转染细胞中含gB基因的mRNA,间接免疫荧光检测表明目的蛋白在CEF中得到了表达。3.通过RT-PCF技术,无需用非特异性免疫原如ConA、PHA等刺激分离的脾淋巴细胞,直接从罗曼鸡脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增鸡IL-18全基因,并克隆和测序。结果表明,鸡IL-18基因全长为597bp。与GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现,罗曼鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致。将该基因片段重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL-18（简称pIL-18）。经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ叹酶切、PCR扩增和基因测序,证实鸡IL-18全基因被正确重组到pcDNA3.1（+）真核表达质粒上；将pIL-18质粒转染Cos7细胞,转染细胞中含鸡IL-18基因的mRNA,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。4.为了检测这2个质粒是否可以诱导动物机体产生特异性免疫,分别用这2个重组质粒和载体质粒pcDNA3.1（+）以及减毒疫苗免疫接种21日龄SPF鸡,免疫分组（A）pgB,（B）pIL-18,（C）pgB和pIL-18,（D）减毒疫苗和pIL-18,（E）减毒疫苗,（F）pcDNA3.1（+）,（G）Control。免疫2次,间隔为2周,每次每只鸡的免疫剂量为100μg。以MTT法检测鸡外周血淋巴细胞经丝分裂原ConA刺激后的增殖反应活性,Real-time PCR检测细胞因子IFN-γ和IL-2的表达水平、流式细胞术检测外周血CD4+T、CD8+T和TCR+T细胞的变化及间接ELISA法检测血清抗体水平。结果表明,ILTV gB基因免疫诱导机体产生了较强的淋巴细胞增殖反应,免疫组外周血中CD4+T、CD8+T和TCR+T细胞明显高于对照组,含IL-18基因的两组（C和D）诱导了高水平的IFN-γ和IL-2表达,载体质粒和空白对照组没有变化,血清抗体在免疫后第2周发生阳转,而对照组无相应变化。这是ILTV基因gB基因和鸡IL-18基因免疫研究的首次报道。第2次免疫后3周,所有鸡以ILTVHN1株强毒0.4mL进行攻毒。攻毒后,非免疫鸡全部发病,并在第2天出现死亡,免疫组部分发病,ILTV HN1株gB基因单独或与鸡IL-18基因联合免疫的保护率分别为79%、86%,而对照组仅为7%。这表明ILTV HN1株gB基因和鸡IL-18基因联合免疫提供了较强的免疫保护,这为ILTV的防制开辟了新的途径。
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