论文摘要
背景和目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是世界范围内主要的感染性疾病之一,慢性感染者约3.5亿,从无症状携带、急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎到肝硬化、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）,形成复杂的疾病谱。持续感染的形成和疾病进程与多种因素有关,如年龄、性别、宿主的免疫状态（婴幼儿感染/成人感染）、HBV基因型、其他病毒重叠感染等。然而,分离分析和双生子研究提示,宿主遗传因素对HBV感染后疾病的表型起着关键作用。而且,HBV感染呈现出明显的地区差异,东亚地区HBV的感染率、慢性携带率、疾病严重程度、流行程度等明显高于欧美地区。因此,宿主因素,尤其是宿主基因影响HBV感染和疾病进程的诸多阶段。近几年,越来越多的研究证实,不同的遗传背景对人类疾病在易感性、疗效和转归等方面已产生影响。其中,单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）是人类DNA变异中最常见的形式,约占其90%,被认为是最有价值的遗传标记,可为将来药物研发、筛选、发展药物基因学,以及根据不同地区人群遗传特点制订的药物“个体化”治疗方案提供理论基础和实验依据。因此,探讨慢性HBV感染的宿主遗传易感性,将为我们从另一个角度认识HBV感染及慢性化机制提供新的线索,并为临床防治提供新的、合理的策略。HBV感染是一个极其复杂的免疫调节过程,其中多种细胞因子在HBV感染后病毒清除的免疫机制中起着重要作用。本课题选择重要的细胞免疫调节因子如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、干扰素-γ（interferon-gamma , IFN-γ）、白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）和IL-18等细胞因子基因作为慢性HBV感染的侯选基因,研究中国汉族人TNF-α基因启动子区、IFN-γ基因第一内含子、IL-10基因启动子区和IL-18基因启动子区或编码区SNP与慢性HBV感染预后的关联,并分析IL-18基因启动子-607C/A、-137G/C位点和编码区105A/C位点SNP与其表达量的关系,探讨它们在HBV感染及感染后疾病进程中的作用,为慢性HBV感染的防治提供理论依据。方法采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism,RFLP）技术检测TNF-α基因启动子-238G/A、-308G/A、-857C/T和-863C/A位点,IL-10基因启动子-1082G/A、-819T/C、-592A/C位点和IL-18基因编码区105A/C位点SNP;采用PCR结合序列特异性引物（sequence specific primers,SSP）检测IFN-γ基因第一内含子+874位点、IL-18基因启动子-607C/A和-137G/C位点SNP;并用RT-PCR和ELISA检测培养的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中IL-18 mRNA的水平和上清液中IL-18的含量。结果一、肿瘤坏死因子-α基因启动子多态性与慢性乙型肝炎易感性的关系1、基因型特点:对131例慢性乙型肝炎患者和126例对照组人群TNF-α基因启动子区-238G/A、-308G/A、-857C/T和-863C/A 4个SNP位点进行基因型分析,共发现12种启动子基因型,以GG·GG·CC·CC、GG·GG·CC·CA、GG·GG·CT·CC和GG·GA·CC·CC基因型多见,约占85%。2、基因型与疾病的关系:通过对TNF-α基因启动子区4个位点基因型分析发现,TNF-α基因启动子-238G/A、-857C/T位点基因型在慢性乙型肝炎患者和对照者间的分布频率差异无统计学意义;而-308G/A、-863C/A位点基因型的分布频率差异有统计学意义（P< 0.05）。3、不同人群间的差异:TNF-α基因启动子区基因型在中国汉族人群中的分布频率与日本、香港人群相似,与白种人之间差异有统计学意义（P< 0.05）。二、干扰素-γ基因第一内含子+874位点多态性与HBV感染预后的关联研究1、基因型特点:在231例慢性HBV感染者、165例HBV感染自限性恢复者和135名对照者中,IFN-γ基因第一内含子+874位点TT基因型分布频率分别为9.1%、13.9%和12.6%;TA基因型分布频率分别为12.1%、23.7%和23.0%;AA基因型分布频率分别为78.8%、62.4%和64.4%。慢性HBV感染组IFN-γ基因+874位点AA基因型频率显著高于自限性恢复组和对照组,而HBV感染自限性恢复组和对照组之间差异无统计学意义（χ2=0.16,P=0.92）。2、基因型与疾病的关系:进一步比较慢性HBV感染者IFN-γ基因+874位点SNP与HBV-DNA复制的关系,发现IFN-γ基因+874位点基因型和等位基因在低水平HBV-DNA组和高水平HBV-DNA组之间的分布频率差异无统计学意义（P >0.05）。3、不同人群间的差异:与其他种族比较,IFN-γ基因+874位点AA基因型和A等位基因在中国汉族人群的分布频率与意大利人或以色列人之间差异有统计学意义（P< 0.05）。三、白细胞介素-10基因启动子多态性与HBV感染预后的关联研究1、基因型特点:IL-10基因启动子-1082G/A、-819T/C、-592A/C位点基因型和等位基因在231例慢性HBV感染者、165例HBV感染恢复者和135例对照者中的分布频率比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2、基因型与疾病的关系:IL-10基因启动子-1082G/A、-819T/C、-592A/C位点基因型和等位基因在慢性HBV感染者组血清HBV-DNA <1×103 copies/mL和HBV-DNA≥1×103 copies/mL亚组之间的分布频率比较差异亦无统计学意义（P>0.05）。3、不同人群间的差异:IL-10基因启动子-819T/C和-592A/C位点基因型和等位基因在HBV无症状携带组和慢性乙型肝炎组之间的分布差异有统计学意义（P< 0.05）,-819 TT型和-592A/C AA型在慢性乙型肝炎组的分布频率明显较高。四、白细胞介素-18基因多态性与慢性HBV感染关系的研究1、基因型特点:在300例对照者和231例慢性HBV感染者中,IL-18基因启动子-607位点3种基因型频率分别为CC型:22%（66/300）和27%（62/231）,CA型:53%（160/300）和50%（116/231）,AA型:25%（74/300）和23%（53/231）。IL-18基因启动子-137位点3种基因型频率分别为GG型:67%（202/300）和79%（182/231）,GC型:30%（90/300）和19%（45/231）,CC型:3%（8/300）和2%（4/231）。IL-18基因编码区105位点3种基因型频率分别为AA型: 69%（208/300）和78%（181/231）,AC型:29%（86/300）和21%（49/231）,CC型:2%（6/300）和1%（1/231）。经χ2检验,慢性HBV感染组IL-18基因启动子-137GG和编码区105AA基因型的分布频率显著高于对照组（χ2=8.55,P=0.003;χ2=6.734,P=0.034）,而-607C/-137C和-607A/-137C单倍型频率显著低于对照组。2、基因型与疾病的关系:进一步分析IL-18基因启动子-607、-137位点和编码区105位点多态性与慢性HBV感染者HBV-DNA复制,以及疾病进展的关系,发现低水平HBV-DNA组和无症状HBV携带组IL-18基因启动子-607位点AA基因型分布频率明显高于高水平HBV-DNA组（χ2=6.03,P=0.014）和慢性乙型肝炎组（χ2=7.77,P=0.021）。3、不同人群间的差异:与瑞典、波兰、澳大利亚等人群相比,中国汉族人群该位点多态性的分布频率,与他们之间的差异有统计学意义（P< 0.05）,仅-137G/C位点基因型分布频率与亚洲日本人群相接近。4、各基因型与PBMC中IL-18的表达关系:（1）在研究对象范围内,IL-18基因启动子-607位点CC、CA和AA基因型个体PBMC分泌IL-18的浓度分别为（11.54±6.48）ng/mL、（10.92±5.16）ng/mL和（11.79±3.18）ng/mL,表达IL-18mRNA水平分别为0.878±0.633、0.877±0.521和0.881±0.400,3种基因型个体PBMC分泌和表达IL-18水平比较,差异无统计学意义（P >0.05）。（2）IL-18基因启动子-137位点GG、GC或CC基因型个体PBMC分泌IL-18的浓度分别为（11.27±5.42）ng/mL和（11.31±4.62）ng/mL,表达IL-18mRNA水平分别为0.835±0.485和0.984±0.613,3种基因型个体PBMC分泌和表达IL-18水平比较,差异无统计学意义（P >0.05）。（3）IL-18基因编码区105位点AA和AC基因型个体PBMC分泌IL-18的浓度分别为（11.26±5.38）ng/mL和（11.31±4.59）ng/mL,表达IL-18mRNA水平分别为0.846±0.493和0.966±0.613,3种基因型个体PBMC分泌和表达IL-18水平比较,差异无统计学意义（P >0.05）。结论通过对TNF-α、IFN-γ、IL-18和IL-10基因SNP与中国汉族人HBV感染预后的关联研究,初步得出如下结论:（1）中国汉族人慢性乙型肝炎易感性与TNF-α基因启动子-308G/A、-863C/A位点多态性有关,其中TNF-α-308GA、-863CA基因型携带者患慢性乙型肝炎风险相对较小。（2）IFN-γ基因第一内含子+874位点多态性与慢性HBV感染有关,提示该位点多态性可能在决定个体HBV感染遗传易感性方面有一定意义。（3）虽然IL-10基因启动子-1082G/A、-819T/C、-592A/C位点多态性与中国汉族人群对HBV易感性及感染后的病毒血症水平无显著相关性;但IL-10启动子-819T/C和-592A/C位点基因多态性与HBV感染后的肝脏炎症反应有关。（4）IL-18基因启动子-607、-137位点和编码区105位点SNP与慢性HBV感染有关,其中IL-18基因启动子-137 C和/或编码区105 C等位基因可能对机体HBV感染有保护作用;而启动子-607AA基因型可能与慢性HBV感染后HBV-DNA的复制和疾病的进展有关;但是IL-18基因启动子-607C/A、-137G/C位点和编码区105位点基因多态性对IL-18分泌和表达量没有明显影响。
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