论文摘要
高效、安全的基因递送载体的研究是目前基因治疗研究的主要难点之一。非病毒基因递送载体由于安全、易组装等特点备受国内外学者的关注。本课题结合磷脂、聚乙烯亚胺（Polyethylenimine,PEI）以及油酸甘油酯的特点,制备了聚阳离子纳米脂质载体（Polycation nanostructured lipid carrier,PNLC）,用于基因递送的研究。本文研究内容包括烷基化聚乙烯合成,PNLC的制备及组分的筛选;PNLC作为绿色荧光蛋白报告基因pEGFP-N2和虫荧光素酶报告基因pGL3-luc递送载体的研究;以SPC-A1细胞为模型,采用加入特异性抑制剂的方法,考察PNLC/DNA复合物的细胞内吞途径和转运机制;采用活细胞显微成像技术观察PNLC/DNA复合物进入细胞以及细胞内转运的过程。本文将溴化十四烷、溴化十六烷和溴化十八烷分别与聚乙烯亚胺（PEI600Da,PEI1200Da和PEI1800Da）反应,合成了27种烷基化聚乙烯亚胺,采用乳化溶剂蒸发法制备PNLC,并对制备工艺进行了优化,制备工艺优化为:超声功率200W,超声时间5min,分散介质为双蒸水。PNLC由烷基化聚乙烯亚胺、油相和磷脂三种成分组成。烷基化聚乙烯亚胺为上述合成的27种不同的烷基修饰的聚乙烯亚胺;油相为油酸甘油酯、中链甘油三酯M812、三肉豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯和辛酸癸酸甘油酯M818;磷脂为卵磷脂EPC和二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE。采用乳化溶剂蒸发法制备PNLC,测定其粒径和zeta电位,与pEGFP-N2质粒结合形成PNLC/DNA复合物,转染SPC-A1细胞,采用荧光分光光度法测定SPC-A1细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度,以SPC-A1细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度为指标,分别筛选PNLC的各项组成。选择油相为三油酸甘油酯、磷脂为卵磷脂EPC,考察烷基化聚乙烯亚胺对PNLC基因转染效率的影响。结果表明PNLC中烷基化聚乙烯亚胺为十六烷基化聚乙烯亚胺时,与三油酸甘油酯和卵磷脂组成的PNLC转染效率较高,而且当烷基化聚乙烯亚胺为十六烷基化PEI1200（1:6）即P12C16（1:6）时,PNLC在SPC-A1细胞中转染pEGFP-N2后,细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度与阳离子脂质体LipofectamineTM2000相当。因此,选择PNLC处方中烷基化聚乙烯亚胺为P12C16（1:6）。选择烷基化聚乙烯亚胺为P12C16（1:6）,磷脂为卵磷脂EPC,考察油相对PNLC基因转染的影响。结果表明当油相为油酸甘油酯和中链甘油三酯M812时,制备的PNLC在SPC-A1细胞中转染pEGFP-N2质粒后,细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度较高。因此,选择PNLC的油相为中链甘油三酯M812和油酸甘油酯（三油酸甘油酯、二油酸甘油酯和单油酸甘油酯）。选择烷基化聚乙烯亚胺为P12C16（1:6）,油相为中链甘油三酯M812、三油酸甘油酯、二油酸甘油酯和单油酸甘油酯,考察磷脂的种类（卵磷脂EPC或者二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE）以及油相/磷脂的比值对PNLC基因转染的影响。结果表明当油相成分为油酸甘油酯时,PNLC在SPC-A1细胞中转染质粒pEGFP-N2后,细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000。PNLC处方中加入油酸甘油酯后,细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度提高。PNLC处方优化结果如下:在由P12C16（1:6）、油酸甘油酯和卵磷脂EPC组成的PNLC中,P12C16（1:6）与卵磷脂的摩尔比值为0.1,三油酸甘油酯与卵磷脂EPC的摩尔比值为1,二油酸甘油酯与卵磷脂EPC的质量比值为2,单油酸甘油酯与卵磷脂EPC的摩尔比值为6;在由P12C16（1:6）、油酸甘油酯和磷脂DOPE组成的PNLC中,P12C16（1:6）与磷脂DOPE的摩尔比值为0.1,三油酸甘油酯与磷脂DOPE的摩尔比值为0.8,二油酸甘油酯与磷脂DOPE的质量比值为0.75,单油酸甘油酯与磷脂DOPE的摩尔比值为1.5。上述六种组成PNLC在SPC-A1细胞和CHO细胞中转染质粒pEGFP-N2,流式细胞仪测定其转染效率,结果表明,在SPC-A1细胞和CHO细胞中,由P12C16（1:6）、三油酸甘油酯或者二油酸甘油酯、卵磷脂组成的PNLC转染效率与阳离子脂质体LipofectamineTM2000相当,而由P12C16（1:6）、单油酸甘油酯和卵磷脂组成的PNLC转染效率显著高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000;由P12C16（1:6）、油酸甘油酯和磷脂DOPE组成的PNLC转染效率显著高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000。PNLC中磷脂为DOPE时的基因转染效率较高。在含有10%血清的条件下,PNLC仍具有较高的基因转染效率。选择由P12C16（1:6）、三油酸甘油酯、DOPE组成的PNLC（PTD）,由P12C16（1:6）、二油酸甘油酯和DOPE组成的PNLC（PDD）,由P12C16（1:6）、单油酸甘油酯和卵磷脂EPC组成的PNLC（PME）,在SPC-A1细胞和CHO细胞中转染虫荧光素酶报告基因pGI3-luc,结果表明在SPC-A1细胞中,三种组成的PNLC的转染效率显著高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000,而且在含有10%血清的条件下具有较高的转染效率;在CHO细胞中,PTD和PDD组成的PNLC的转染效率显著高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000,而且在含有10%血清的条件下,均具有较高的转染效率,但是PME组成的PNLC的转染效率非常低。选择PTD、PDD和PME组成的PNLC,以SPC-A1细胞为模型,采用加入特异性抑制剂的方法,考察PNLC/DNA复合物进入细胞的内吞途径以及细胞内的转运机制。分别加入网格蛋白内吞途径抑制剂氯丙嗪和陷穴小泡内吞途径Filipin,测定PNLC/DNA复合物的内吞情况以及虫荧光素酶报告基因在细胞内的表达情况。结果表明在SPC-A1细胞中,加入氯丙嗪后,PNLC/DNA复合物的内吞降低,细胞中表达的luciferase活性降低了近90%,而加入Filipin后,PNLC/DNA复合物的内吞和细胞中表达的luciferase的活性均没有显著性的变化。因此推断PNLC/DNA复合物通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。为了证明这一推断,分别对PNLC/DNA复合物和细胞内溶酶体用荧光探针进行标记,用激光共聚焦显微镜观察发现PNLC/DNA复合物进入细胞后与溶酶体的重合,因此,PNLC/DNA复合物主要是通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。细胞内微管和摩托蛋白对细胞内的膜泡转运具有非常重要的作用,加入微管解聚剂nocodazole和微管稳定剂paclitaxel,动力蛋白抑制剂原钒酸钠（SOV）和驱动蛋白Eg5抑制剂monastrol,测定SPC-A1细胞内表达的luciferase的活性,考察微管和摩托蛋白对于PNLC/DNA复合物在SPC-A1细胞内转运的影响。结果表明SPC-A1细胞中加入微管解聚剂nocodazole和微管稳定剂paclitaxel后,细胞中几乎没有luciferase表达;加入原钒酸钠后细胞中的luciferase的活性提高了50%,加入monastrol后PTD和PDD组成的PNLC转染后luciferase活性降低,而PME组成的PNLC转染后luciferase活性没有显著性变化,同时加入原钒酸钠和monastrol后,细胞内表达的luciferase活性均发生不同程度的降低。这些结果表明,微管和摩托蛋白对于PNLC/DNA复合物在细胞内的转运具有非常重要的影响。为了进一步考察PNLC/DNA复合物进入细胞的过程以及细胞内的转运情况,选择PME组成的PNLC,PNLC用绿色荧光探针FITC标记,质粒DNA用红色荧光探针TM-Rhodamine进行标记,用激光共聚焦显微镜跟踪PNLC/DNA复合物进入细胞以及在细胞内转运的过程。观察结果表明PNLC能够压缩质粒DNA形成PNLC/DNA复合物,内吞进入细胞后,通过早期内吞泡-晚期内吞泡-溶酶体的路径转运到细胞核核周围区域,烷基化聚乙烯亚胺和质粒DNA均可转运进入细胞核。
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