基因多态性对中国肝移植受体预后的影响

论文摘要

【前言】普乐可复（FK506，Tacrolimus）是一种新型的钙调磷酸酶（Calcineurin）抑制剂，临床研究已证实其在预防实体器官移植后急性排斥反应的发生中有卓越的效果，但是有效治疗剂量范围较窄和药物体内动力学变化大是限制其最大限度发挥疗效的障碍。近来的研究都纷纷把研究重点放在了造成钙调蛋白抑制剂个体间效果差异上来。已有研究证明，P-糖蛋白（PGP1）的生物活性对药物的个体间差异有明显的影响。PGP1是MDR1基因的编码产物，其作为一种转运蛋白可以将其作用底物从细胞膜的胞浆面泵出至细胞外，这些底物包括多种内源性代谢产物以及各种药物，而普乐可复就是其底物之一。PGP1主要分布于肝脏、肾脏以及小肠中，小肠中的PGP1主要位于成熟肠粘膜的凸向肠腔的顶端，其通过将外源性物质主动从细胞内转运至肠腔来减少肠道对这些物质的吸收。有研究证明，造成钙调蛋白抑制剂药物动力学的个体间差异的主要原因在于PGP1的蛋白活性的个体间不同。而MDR1基因（ABCB1）第3435位点（第26外显子内）的核苷酸由C突变为T将明显降低PGP1蛋白的表达。由此推测这种单核苷酸多态性可能解释了造成普乐可复个体间药动学存在较大差异的部分原因，也可能影响了此类药物口服后的吸收。【目的】探讨肝移植供受体多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）（ABCB1）3435位点多态性对受体服用普乐可复（FK506，Tacrolimus）剂量和血药浓度个体差异间的关系。【方法】选择2004年7月至2005年3月在我院接受原位肝移植术患者50例，监测口服普乐可复肝移植受体的体重、服药剂量、全血药谷浓度，在服药后1周、2周和1月设置统计检测时间点。取供体和受体外周血、病肝或脾脏标本，提取基因组DNA，PCR扩增MDR1基因，用限制性位点多态性分析（Restriction site Polymorphism，RSP）的方法检测供受体MDR1第3435位C／T基因型，同时用DNA直接测序法检测MDR1 3435位点基因型，验证PCR-限制性位点多态性分析结果。计算每日每公斤体重的FK506用量、血药浓度与每日每公斤体重的FK506用量的比值，以此对供受体MDR1基因型与受体用药间的关系进行分析。【结果】在50例受体中，MDR1基因第3435位点CC基因型、CT基因型和TT基因型各有8例（16％）、35例（70％）和7例（14％）。50例供体中有CC型15（30％）例，CT型29（58％）例，TT型6（12％）例。供受体MDR1基因型17例不符，而供受体基因型构成比无统计学差异（P＞0.05）。在本研究所观察的100例人群中，MDR1第3435位点CC型、CT型和TT型各占23％、64％和13％。为维持受体术后的目标血药浓度水平，其服用FK506的剂量存在较大的个体间差异，肝移植受体在服用FK506 1周、2周和1月时，FK506口服用药剂量分别为0.014～0.175mg／kg／d、0.017～0.182mg／kg／d、0.022～0.179mg／kg／d。MDR1CC基因型受体在术后1周、2周和1月时，每日每公斤体重的FK506用量均明显高于CT和TT基因型受体，前者血药谷浓度与每日每公斤体重的FK506用量的比值均显著低于后两者。供体MDR1基因型对这些指标无明显影响。【结论】1．肝移植术后要维持一定的血药浓度，FK506口服需药剂量在个体之间存在极大差异。2．个体之间FK506口服需药量的这种差异与其MDR1的遗传多态性密切相关。3．受体MDR1基因的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）较供体对这种差异的影响更大。检测受体的MDR1基因多态性对预测个体的FK506给药剂量有参考意义。【前言】随着免疫抑制治疗及预防原发病复发治疗的方案不断发展，近十年来肝移植存活率及术后生存率得到明显提高。但是，术后移植物失功仍较常见，文献报道第一年出现移植肝失功的比例大约为13％，而五年内达到35％。而出现这种情况最主要的两种原因仍然是免疫相关的移植物急、慢性排斥反应及肝脏原发疾病（在中国主要为乙型肝炎和肝癌）的复发。免疫反应的发生、发展与人体内环境的改变密切相关，而免疫活性细胞及间质细胞分泌的细胞因子决定了内环境的进一步发展。细胞因子网络在患者移植后的免疫环境中起了很大的作用，所以它们与移植后排斥反应的发生及原发病的复发等并发症息息相关。细胞因子在调节免疫反应中起了很大的作用，而且其表达量的轻微改变是乎就可以导致不同的反应结果。细胞因子的产量主要由基因控制，而其基因型在遗传上存在多态性，所以其合成量及水平存在很大的个体差异。例如，有研究显示TNF-α在启动子位置-308位点稀有碱基（G＞A）的出现可以影响其转录水平增加6至7倍。然而，IL-10-1082位G到A的突变会减少IL-10的产量。人体内的各种免疫反应或者排斥反应的发生肯定受到个人由于基因多态性造成的细胞因子产物量不同影响。目前有很多中心报道了关于细胞因子多态性与肝移植后急性排斥反应的关系，但是结果很不一致，而且此些研究主要集中高加索人种。国外有研究报道TNF-α、IL-10等细胞因子基因多态性与肝移植后丙肝复发相关，但未见与乙肝复发关系的研究报道。明确细胞因子基因多态性与肝移植后急性排斥反应和乙肝复发的关系，可制定免疫抑制剂及预防乙肝复发治疗的个体化用药方案。为此，本研究欲检测国外研究比较热，争议也比较多的三个细胞因子，TNF-α，IL-10，和TGF-β1的基因多态性，明确其与中国肝移植患者预后的关系。【目的】本研究的目的为明确细胞因子基因多态性与中国人肝移植后急性排斥反应及乙肝复发的关系，寻找可以预测肝移植预后的基因标记，为以后制定个性化的免疫抑制及预防乙肝复发方案提供指导。【方法】随访2004年1月至2005年12月在本中心接受肝移植合并乙肝相关性疾病的患者186例，其中男性165例，女性21例，平均年龄46±9岁（19-67岁）。术后免疫抑制剂采用以环孢霉素（CSA）或他克莫司（FK506）为主的三联方案；预防乙肝复发采用乙肝免疫球蛋白（HBIG）+拉米呋啶方案。术后对临床表现、实验室检查提示可能发生排斥反应的患者，常规B超引导下行肝穿刺活检，进行病理检查，根据病理结果诊断急性排斥反应。术后复查乙肝三系，血清中HBsAg再次阳性定义为乙肝复发。提取入选患者肝脏或者外周血中DNA，经PCR扩增后采用ABI公司的BigDye3.1试剂盒测序，用Polyphred分析基因组α-肿瘤坏死因子（TNF-α）（-308／-238），IL-10启动子（-1082／-819／-592），和β1-转化生长因子（TGF-β1）（-988／-800／-509／+869／+915）的基因多态性。为验证DNA直接测序结果的可靠性，实验随机提取60例样本对IL-10基因-819位点进行PCR-限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）法分析该位点多态性与直接测序进行对比。x2（卡方）检验比较在急性排斥反应组和无急性排斥反应组及乙肝复发组和无复发组中的基因型分布，P＜0.05表示差异有显著性。【结果】本组186例肝移植患者中，随访得到41例至少发生一次急性排斥反应，急性排斥反应发生率为22％。乙肝复发29例，乙肝总体复发率为15.6％。本研究人群中未检测到TNF-α-308AA／-238AA及IL-10-1082GG等细胞因子高分泌基因型。TNF-α-308GA／-238GA及IL-10-1082GA在急性排斥反应组的分布比例分别为14.6％、2.4％及12.2％，在无急性排斥反应组中的分布比例为10.3％、3.4％及11.7％，在两组中各基因型分布无显著性差异（P＞0.05）。在乙肝复发组中TNF-α-308GA／-238GA及IL-10-1082GA基因型分布比例分别为20.7％、6.9％及20.7％，而在无复发组中的分布比例为9.6％、2.6％及10.2％，两者也无显著性差异（P＞0.05）。IL-10-819／-592两单核苷酸位点呈完全连锁不平衡，其纯合突变（CC／CC）在人群中较少见（8％）。IL-10-819／-592不同基因型在急性排斥反应组与无急性排斥反应组分布比例分别为TT（AA）31.7％与44.8％，TC（AC）51.2％与49.7％，CC（CC）17.1％与5.5％，两组间TT（AA）与TC+CC（AC+CC）分布无显著性差别（P＞0.05）。在乙肝复发组与无复发组，TT（AA）44.8％与41.4％，TC（AC）44.8％与51.0％，CC（CC）10.4％与7.6％，两组间分布比例也无显著性差别（P＞0.05）。本研究人群中未发现TGF-β1-988／-800／+915位点单核苷酸多态性。TGF-β1-509TT／TC／CC在急性排斥反应组与无排斥组中的分布分别为24.4％与27.6％、61.0％与53.8％、14.6％与18.6％；TGF-β1+869CC／CT／TT在急性排斥反应组与无排斥组中的分布比率分别为24.4％与28.3％、53.7％与40.7％，21.9％与31.0％，两基因型在两组中分布无显著性差异（P＞0.05）。TGF-β1-509TT／TC／CC在乙肝复发组与无复发组中的分布比率分别为27.6％与26.8％、44.8％与57.3％、27.6％与15.9％；TGF-β1+869CC／CT／TT在乙肝复发组与无复发组中的分布比率分别为31.0％与26.7％、31.0％与45.9％、38.0％与27.4％，两基因型在两组中分布也无显著性差异（P＞0.05）。TGF-β1-509／+869两单核苷酸位点呈连锁不平衡。【结论】1．细胞因子TNF-α，IL-10，及TGF-β1的基因多态性与中国人肝移植后排斥反应无明显相关性。2．细胞因子TNF-α，IL-10，及TGF-β1的基因多态性与中国人肝移植后乙肝复发亦无明显相关性。3．在中国人中细胞因子TNF-α-308AA／-238AA及IL-10-1082GG等高分泌基因型极少见。4．TGF-β1-988／-800／+915的单核苷酸多态性在中国人中也极少见。【前言】乙肝免疫球蛋白（HBIG）对于乙肝相关肝移植受体术后乙肝复发有明显的抑制作用，但是临床研究发现，乙肝相关性肝病患者肝移植后使用相同的药物（拉米呋啶+HBIG）预防乙肝治疗后，仍有部分患者复发了乙肝，提示乙肝相关肝移植受体对于HBIG治疗的敏感性可能存在个体差异。HBIG作为IgG抗体的一种，其在体内通过与Fc受体结合后发挥抗乙肝病毒的疗效。研究显示人白细胞表面FcγRⅢ（CD16）与ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）过程有密切关系，而其中的FcRⅢ-A是NK细胞和单核细胞表面跨膜受体，其主要作用是结合IgG，其编码基因FCGR3A第559位点具有单核苷酸多态性（T／G），不同的等位基因分别编码氨基酸序列158位的苯丙氨酸（F）或缬氨酸（V），研究显示FcγRⅢa-158V比FcγRⅢa-158F可以结合更多的IgG1和IgG3。而HBIG是IgG的一种，因而推测HBIG必然会受到FcR基因多态性的影响，从而抑制乙肝复发的效果。【目的】本研究通过检测因乙肝相关性肝病行肝移植患者的FCGR3A基因多态性，研究其人群分布特点，并分析其对HBIG临床应用效果的影响，探索FCGR3A基因多态性T／G与肝移植患者预后的关系，为更好地指导临床用药及判断预后提供参考。【方法】随访浙江大学附属第一医院肝移植中心2004年1月至2005年11月间术前诊断为乙肝相关性肝病（暴发性肝炎，急慢性重症肝炎，乙肝肝硬化，乙肝后肝癌等）施行肝移植，术后使用HBIG预防乙肝复发治疗，且存活时间大于1年的患者共77例。提取入选患者的DNA，经PCR扩增后采用ABI公司的BigDye3.1试剂盒对77例患者的FCGR3A基因型进行测序，用Polyphred分析其559核苷酸位点（T／G）的单核苷酸多态性，x2（卡方）检验比较在乙肝复发组及无复发组中的基因型频率，Kaplan-Meier法检验比较基因型不同组间乙肝无复发累计生存率，进而分析FCGR3A基因第559位单核苷酸多态性与乙肝复发的关系。P＜0.05认为差异统计学上有显著性意义。【结果】本组77例肝移植受体（其中男性70例，女性7例），平均年龄45.2±8.1岁，平均随访时间623±169天（360—996天），乙肝复发16例。术后乙肝1年和2年复发率分别为14.3％和18.2％，复发时间从4天到627天（中位复发时间231天）。基因测序发现FCGR3A基因型TT 35例（45.4％），TG 31例（40.3％），GG 11例（14.3％）。559G基因携带组（基因型为TG或GG）42例（54.5％），乙肝复发率为9.5％，1年和2年无复发累计生存率分别为95.2％和88.7％；559G基因未携带组（基因型为TT）35例（45.5％），乙肝复发率为28.6％，1年和2年无复发累计生存率分别为74.3％和69.3％。x2检验示559G基因携带组和未携带组之间乙肝复发率有显著性差异（P＜0.05），Kaplan-Meier检验示两组肝移植术后无复发累计生存时间有显著性差异（P＜0.05）。【结论】1．中国人FCGR3A基因559位点存在单核苷酸多态性，且此突变在人群中较常见。2．HBIG预防中国乙肝相关肝移植受体术后乙肝复发的效果受FCGR3A基因559位点单核苷酸多态性影响。3．检测FCGR3A基因多态性对HBIG个性化用药有参考意义。

论文目录

• 序言
• 第一部分
• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、正文MDR1第3435位点基因多态性对肝移植受体术后普乐可复治疗剂量影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分
• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、正文 细胞因子基因多态性与中国肝移植受体急性排斥反应发生及乙肝复发的关系
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分
• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、正文FcγRⅢA（CD16）基因多态性对中国乙肝相关肝移植受体乙肝免疫球蛋白（HBIG）疗效的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一 MDR1和CYP3A基因多态性在肝肾移植领域的应用
• 参考文献
• 综述二 细胞因子基因多态性与乙型肝炎及肝移植后排斥反应关系的研究进展
• 参考文献
• 综述三 CD16基因多态性与免疫相关性疾病研究进展
• 参考文献
• 结语
• 在读期间以第一著者发表的文章
• 在读期间著作及获奖情况
• 在读期间以项目负责人申请课题情况
• 致谢