氯酚/硝基苯厌氧降解体系中微生物种群结构研究

论文摘要

有毒有机物的厌氧降解具有能耗低、效率高、无二次污染等优点，本课题针对两类常见的有毒有机污染物氯酚(（2-monochlorophenol，简称2-氯酚；4-monochlorophenol，简称4-氯酚；2，4-dichlorophenol，简称2，4-二氯酚）／硝基苯进行厌氧降解，并对这些厌氧体系中微生物种群结构进行研究。通过颗粒污泥样品DNA提取、特异性引物的PCR扩增、DGGE分析，自制感受态细胞进行连接转化、阳性克隆子测序、序列分析归纳，特异性荧光探针结合、流式细胞计数等方法，分别对2-氯酚、4-氯酚、2，4-二氯酚／硝基苯厌氧降解体系中的细菌、古菌、硫酸还原菌、各种产甲烷菌等微生物种群分布进行分析。结果证实，通过以上方法可以有效的对有毒有机物厌氧降解体系中特定的微生物群落组成进行分析。厌氧颗粒污泥经过2-CP驯化后，检出的古细菌类型由驯化前的17种增加到23种；经过4-CP驯化后，检出的古细菌类型由驯化前的17种增加到19种。有9种古细菌只在降解2-CP的厌氧污泥中被检出，在接种污泥和降解4-CP厌氧污泥中均未被检出，说明这些古细菌更易于适应2-CP的驯化，而不适应4-CP的降解。7种古细菌在接种污泥、2-CP驯化污泥、4-CP驯化污泥中均被检出，它们很有可能是降解氯酚类物质的主要古细菌。2-CP驯化前后的厌氧颗粒污泥中存在4种共有的酸杆菌，经2-CP驯化后，接种污泥中8种酸杆菌菌种发生消亡，并出现了7种新的菌种。考察了降解2，4-二氯酚的ASBR的顶部、中部及底部污泥中微生物种群结构，底部污泥的古细菌有15种，顶部有14种古菌，而反应器中部的菌种结构最为简单，有10种古菌；反应器各部位的污泥中有10种共有的古菌。接种污泥在经过2，4-DCP驯化后，ASBR各层污泥中古菌多样性明显减少，底部污泥古菌种群丰度变化最为明显。在接种污泥以及降解氯酚类物质的各厌氧系统中，甲烷杆菌的含量都远远高于甲烷鬓菌和产甲烷菌属，说明甲烷杆菌是降解氯酚类物质厌氧系统的优势甲烷菌。用铜、铬、镍等重金属离子对降解2-氯酚的厌氧系统进行冲击后发现，重金属离子的冲击会改变细菌和古细菌的种群结构。与对照样品中检出的23种古细菌相比，Cu2+冲击后系统中古菌类型降到18种，在恢复期继续降低到9种，导致Cu2+冲击对系统抑制作用最强，需要的恢复期也最长。Cd2+冲击3d后污泥中检出了30种古菌，而恢复10d后，只检出了14种古菌，导致了Cd2+冲击后系统的恢复缓慢。与Cd2+、Cu2+系统中古菌种类数减少相反，Ni2+冲击后系统的古菌类型增加到30种，在恢复10d后继续增到39种，远高于同期的Cd2+、Cu2+系统中古菌的种类数。虽然Ni2+冲击后系统受到抑制，但是恢复的周期相对较短。分别考察了中性、碱性、加入FeCl2（100mg／L，pH中性）条件下的硝基苯厌氧降解体系中微生物的种群分布状况。经硝基苯驯化后的厌氧污泥中，古菌种群分布最为丰富，为93种；中性和碱性条件下的硝基苯厌氧降解污泥中均有89种古菌类型；FeCl2（100mg／L，pH中性）存在条件下的硝基苯厌氧降解污泥中古菌类型为87种。硝基苯厌氧降解体系中检出的古菌种类数量及各样品共有的古菌种类数量都远远高于氯酚类（2-CP，4-CP，2，4-DCP）厌氧降解系统中检出的古菌种类。除了在氯酚厌氧降解系统中的主要菌种和优势菌种Unculturedarchaeon（TA05、TA04、TA01）、Methanothrix soehngenii（索式甲烷发菌）、Methanosaeta concilii（甲烷鬓毛菌）外，在硝基苯厌氧降解体系中，古菌类型丰富多样且分布均匀，主要菌种的地位表现不明显，古菌类型主要集中在甲烷杆菌纲、甲烷球菌纲及甲烷微菌纲中的甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷球菌属（Methanococcus）、甲烷螺菌属（Methanospirillum）、甲烷囊菌属（Methanoculleus）。对常温下处理城市生活污水的厌氧颗粒污泥进行分析，在反应器底部、中部和顶部污泥中，有14种共有的古菌。反应器中部污泥的古菌结构最为丰富，有45种古菌；反应器顶部检出的古菌有21种；而反应器底部的菌种结构最为简单，有18种古菌。反应器各层污泥样品中，甲烷杆菌的含量都低于甲烷鬓菌和甲烷微菌；在底部及顶部污泥中，甲烷鬓菌的检出频率最高，含量最高，是优势菌种；在中部污泥中，甲烷微菌含量高于甲烷鬓菌与甲烷杆菌，是优势菌种。各层污泥中，SRB的含量均低于甲烷鬓菌，均大于甲烷杆菌。

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摘要

ABSTRACT

第1章引言

1.1 国内外研究现状与发展动态

1.1.1 氯酚/硝基苯的性质

1.1.2 氯酚/硝基苯类化合物的降解途径

1.1.3 氯酚/硝基苯类化合物的生物处理技术

1.1.4 降解氯酚/硝基苯的微生物研究进展

1.2 现代生物学技术及其在环境领域中的应用

1.2.1 16S rDNA/18S rDNA在系统进化研究中的应用

1.2.2 厌氧微生物

1.2.3 本课题的技术路线

1.2.4 实验技术存在的偏差

1.3 课题研究的意义和内容

第2章实验材料与分析方法

2.1 厌氧工艺装置及实验方法

2.1.1 污泥驯化装置

2.1.2 摇瓶实验装置

2.1.3 氯酚/硝基苯厌氧降解污泥的驯化

2.1.4 摇瓶实验方法设计

2.1.5 实验设备和试剂

2.2 常规指标分析方法

2.2.1 有机物浓度的分析方法

2.2.2 进出水溶解性COD

2.2.3 重量法分析MLSS和MLVSS

第3章微生物种群结构分析方法

3.1 厌氧颗粒污泥DNA提取

3.1.1 厌氧污泥样品细菌基因组DNA的提取

3.1.2 厌氧颗粒污泥中真菌DNA的提取

3.2 PCR扩增

3.2.1 细菌16S rDNA的PCR扩增及纯化

3.2.2 真菌18S rRNA的PCR扩增

3.3 16S rDNA/18S rDNA的DGGE分析

3.4 降解2-CP厌氧微生物的培养及其种群结构分析

3.5 克隆和测序

3.5.1 E.coli DH5a感受态细胞的制备

3.5.2 T-vector（T载体）制作方法

3.5.3 商品化的pMD19-T Vector

3.5.4 克隆实验操作

3.6 流式细胞法对微生物种群的定量分析

3.7 本章小结

第4章氯酚类有机物厌氧降解体系中微生物种群结构分析

4.1 降解2-CP和4-CP的厌氧颗粒污泥中微生物种群结构分布

4.1.1 2-CP/4-CP厌氧降解系统中微生物多样性比较

4.1.2 2-CP驯化前后酸杆菌的多样性分析

4.2 降解2,4-DCP的厌氧颗粒污泥古细菌种群结构分布

4.2.1 降解2,4-DCP的反应装置

4.2.2 降解2,4-DCP的厌氧颗粒污泥的驯化及样品采集

4.2.3 降解2,4-DCP厌氧颗粒污泥中微生物种群结构分析

4.3 用FCM对氯酚类物质厌氧降解系统中微生物种群的初步定量

4.4 本章小结

第5章硝基苯厌氧降解微生物种群结构研究

5.1 反应设计

5.2 硝基苯厌氧降解微生物种群分析

5.3 本章小结

第6章处理城市污水的厌氧污泥微生物种群结构分析

6.1 实验装置

6.2 OCAR厌氧颗粒污泥微生物种群分布

6.2.1 基于16S rDNA克隆法分析OCAR厌氧颗粒污泥中古菌的分布

6.2.2 应用FCM定量分析OCAR中厌氧颗粒污泥微生物种群分布

6.3 本章小结

第7章金属离子对2-氯酚厌氧降解体系微生物种群分布的影响

7.1 实验设计及分析方法

7.1.1 冲击及恢复性驯化实验方法

7.1.2 运用PCR-DGGE分析金属离子冲击对细菌种群结构的影响

7.1.3 运用克隆技术分析金属离子冲击对古细菌多样性的影响

7.1.4 运用FCM技术定量分析金属离子冲击后微生物种群结构的分布

2+冲击对2-CP厌氧降解系统中微生物种群结构的影响'>7.2 Cu²⁺冲击对2-CP厌氧降解系统中微生物种群结构的影响

2+冲击对厌氧系统细菌种群结构的影响'>7.2.1 Cu²⁺冲击对厌氧系统细菌种群结构的影响

2+冲击对厌氧系统古菌多样性的影响'>7.2.2 Cu²⁺冲击对厌氧系统古菌多样性的影响

2+冲击对厌氧系统微生物种群分布影响的定量分析'>7.2.3 Cu²⁺冲击对厌氧系统微生物种群分布影响的定量分析

2+冲击对2-CP厌氧降解系统中微生物种群结构的影响'>7.3 Cd²⁺冲击对2-CP厌氧降解系统中微生物种群结构的影响

2+冲击对厌氧系统细菌种群结构的影响'>7.3.1 Cd²⁺冲击对厌氧系统细菌种群结构的影响

2+冲击对厌氧系统古菌多样性的影响'>7.3.2 Cd²⁺冲击对厌氧系统古菌多样性的影响

2+冲击对厌氧系统微生物种群分布影响的定量分析'>7.3.3 Cd²⁺冲击对厌氧系统微生物种群分布影响的定量分析

2+冲击对2-CP厌氧降解系统中微生物种群结构的影响'>7.4 Ni²⁺冲击对2-CP厌氧降解系统中微生物种群结构的影响

2+冲击对厌氧系统细菌种群结构的影响'>7.4.1 Ni²⁺冲击对厌氧系统细菌种群结构的影响

2+冲击对厌氧系统古菌多样性的影响'>7.4.2 Ni²⁺冲击对厌氧系统古菌多样性的影响

2+冲击对厌氧系统微生物种群分布影响的定量分析'>7.4.3 Ni²⁺冲击对厌氧系统微生物种群分布影响的定量分析

7.5 金属离子冲击对2-CP厌氧降解系统影响的比较

7.5.1 金属离子冲击对2-CP厌氧降解影响的比较

7.5.2 金属离子冲击对厌氧系统细菌种群分布影响的比较

7.5.3 金属离子冲击对厌氧系统古菌多样性影响的比较

7.5.4 金属离子冲击对厌氧系统微生物种群分布影响比较

7.6 本章小结

第8章几种厌氧体系中微生物种群结构分布比较

第9章结论与建议

9.1 结论

9.2 建议

致谢

参考文献

个人简历在读期间发表的学术论文与研究成果

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