SV40T荧光真核表达载体构建及转染大鼠胰岛细胞的研究

论文摘要

目的构建猿猴病毒40大T抗原（SV40T）荧光真核表达载体,将其转染大鼠胰岛细胞,观察胰岛细胞生物学特征及基因的变化。方法采用基因重组技术,先用NotⅠ和XhoⅠ将SV40T片断从pCMV-SV40T质粒上双酶切下来,回收后克隆到克隆载体pSC-A中成为pSC-SV40T;再用XhoⅠ和SacⅡ将SV40T片断双酶切下来,回收后正向克隆到荧光真核表达载体pIRES2-ZsGreenl中,XhoⅠ和SacⅡ双酶切鉴定。采用脂质体法,将重组基因pIRES2-ZsGreenl-SV40T和pIRES2-ZsGreenl分别转染原代培养的大鼠胰岛细胞,G418筛选,采用荧光显微镜、RT-PCR及细胞免疫荧光检测绿色荧光及SV40T在胰岛细胞中的表达;对建立的胰岛永生化细胞系,通过胰岛素分泌量、葡萄糖刺激胰岛素释放实验、软琼脂克隆形成实验、细胞免疫荧光、细胞生长曲线和染色体核型分析动态监测永生化胰岛细胞生物学特征的变化,通过RT-PCR动态监测胰岛细胞基因的变化。结果经XhoⅠ和SacⅡ双酶切后,重组质粒被切成5.3kb和2.4kb 2个片段,与理论预期长度相符;经pIRES2-ZsGreenl-SV40T和pIRES2-ZsGreenl转染的大鼠胰岛细胞在荧光显微镜下均可见绿色荧光,生存期延长;经pIRES2-ZsGreenl-SV40T转染的胰岛细胞,RT-PCR及细胞免疫荧光证明整合有SV40T,ELISA及细胞免疫荧光证明基础胰岛素分泌及葡萄糖刺激胰岛素释放能力随着永生化细胞系传代逐渐减弱,软琼脂培养无克隆形成,染色体无异常变化,RT-PCR证明永生化后的胰岛细胞随着时间推移出现了胰岛内分泌祖细胞的特异性基因Ngn3。结论成功构建了SV40T荧光真核表达载体,并可在大鼠胰岛细胞中表达;经pIRES2-ZsGreenl-SV40T转染的胰岛细胞生存期延长,但生理功能减弱,有向祖细胞逆转的趋势。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 第一章 前言
• 第二章 SV40T荧光真核表达载体的构建
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 原代大鼠胰岛细胞培养及转染实验
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩略语
• 综述
• 在校期间发表论文
• 致谢